酶标记抗体-HRP标记抗体-戊二醛二步法
实验概要
本实验介绍了酶标记抗体-HRP标记抗体中的戊二醛二步法的操作流程。
实验原理
戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
主要试剂
1. 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。
2. 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
3. 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
4. 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。
5. 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。
6. PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
7. 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
8. 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
9. HRP(RZ>3.0)。
主要设备
1. Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
2. 搅拌器，分光光度计，离心机。
3. 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
实验步骤
1. 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
2. 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
3. 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
4. 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。
5. 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
6. 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
7. 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
8. 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
9. 结果判定：
1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。
最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定
2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。
