使用自动细胞成像系统进行细胞毒性评价和细胞活死测定
简介
细胞活 / 死测定被广泛应用于各种研究领域，包括各种化合物的细胞毒性作用、实验处理或基因表达变化的研究。自动细胞成像和分析系统提供了一种评价细胞活性和细胞死亡的最佳方法。在本篇应用文献中，我们介绍了使用 ImageXpress®Pico 自动细胞成像系统以及 CellReporterXpress 自动图像采集和分析软件对 EarlyToxTM Live/Dead 检测试剂处理的细胞进行成像。EarlyTox Live/Dead 检测试剂盒包含了针对哺乳动物活细胞和死细胞的标记物。活细胞可被在细胞质中能够发出强烈绿色荧光的Calcein AM 染色。不发荧光的 Calcein AM 可穿透完整细胞膜且其乙酰羟甲基酯 (AM) 基团可被细胞内的脂酶裂解，得到可发出荧光的钙黄绿素分子。死细胞标记物乙啶二聚体-III(EthD-III) 对完整细胞质膜而言既无荧光也无穿透能力。当与死亡细胞相关的细胞膜完整性受到损伤时，EthD-III 进入细胞并与细胞核结合，在细胞中产生明亮的红色荧光。影响细胞膜完整性的细胞毒性事件可以使用这种方法准确的评估。该检测试剂盒可对测试化合物的全浓度响应特性进行表征。这种免洗、均相实验可减少因为洗涤步骤导致的死细胞被冲洗掉的情况。使用 ImageXpress Pico 系统和 CellReporterXpress软件能准确检测到来自钙黄绿素和 EthD-III 的荧光信号并获得高质量的图像及分析结果。
材料 EarlyTox Live/Dead Assay Kit |
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方法
HeLa 细胞以 5,000 细胞 / 孔接种于黑色 384孔底透微孔板中，37°C, 5% CO2 孵育箱内生长过夜。用十字孢碱 (staurosporine )( 通用蛋白激酶抑制剂和潜在的抗癌治疗药物 ) 或丝裂霉素 C ( 强效DNA交联剂与化疗药物 ) 处理细胞 24 小时，做 4 个平行，按1:3 梯度稀释，起始最高浓度为 10 μM 十字孢碱和 300 μM 丝裂霉素 C。化合物处理完成后，用 Live/Dead 检测试剂结合 Hoechst33342 核染料 (Thermo Fisher)对细胞进行染色。每孔移去一半体积液体并替换成 2x Calcein AM 和EthD-III 染色液。染色液浓度为 2 μM Calcein AM 和3 μM EthD-III。在添加 Hoechst ( 6 μM 终浓度 ) 前，孔板在 37°C, 5% CO2 下孵育30 分钟。细胞再次以 37°C, 5% CO2 孵育15 分钟。最后一次孵育结束后立即将孔板在 ImageXpress Pico 系统上用 10xPlan Fluor 物镜进行成像，荧光通道分别为针对 Calcein AM 的 FITC 通道、针对 EthD-III的 Texas Red 通道和针对 Hoechst 染料的 DAPI 通道。在此放大倍数下，一张单独的图像一个视野下可以采集多达4000-4500 个细胞，足以获得统计学相关结果。
使用细胞分类模块进行图像分析
利用 CellReporterXpress 软件中的细胞分类分析模块对图像进行分析。此模块可识别和区分活细胞或死细胞。Hoechst染色用于识别总细胞，而 Calcein AM 或EthD-III 作为特异性染色用于将细胞分类为阳性或阴性。图1展示了用十字孢碱处理和未处理的阳性细胞和阴性对照以及相关分析所识别的阳性和阴性细胞。分别进行分析，以确定活细胞或死亡细胞的数量和百分比。从剂量-应答曲线计算EC50毒性对活细胞和死细胞成像，并基于 CalceinAM (绿色荧光) 或 EthD-III (红色荧光) 的细胞阳性染色进行细胞分类定量分析 ( 图1 )。用十字孢碱和丝裂霉素 C 处理 HeLa细胞均展示出浓度依赖性的死细胞百分比的增加和活细胞百分比的下降。图2所呈现的剂量应答曲线，活细胞百分比对化合物浓度，其十字孢碱的 EC50 值为 0.569μM，而丝裂霉素 C 是 223 μM。死细胞百分比曲线得到的十字孢碱 EC50 值为 0.492μM 而丝裂霉素 C 为 6.305 μM。
总结
EarlyTox Live/Dead 检测试剂盒结合ImageXpress Pico 系统和 CellReporterXpress软件，能够通过简单高效的工作流程实现对活细胞和死细胞的精确测定。自动成像和定量分析使得我们能够测试毒性化合物并非常适合于大量生物学检测中对细胞活性的评价。
