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实验室分析仪器--色谱柱的清洗与再生介绍

2022.2.01

除非特殊说明,在所有情况下,所用溶剂的体积应该是色谱柱体积的40~60倍。应在清洗过程开始和结束时各测一次柱效和容量因子等色谱参数,比较色谱柱性能的改善,以确定清洗的效果。确保色谱柱中没有样品和缓冲溶液,清洗前所用的溶剂应与最初清洗时所用的溶剂相溶。应确保实验测试时所用的流动相与色谱柱中最后的溶剂相溶。

1.柱子的清洗

即使样品和流动相己做过前处理,也仍难以完全避免柱子受到污染,因此必须对柱子进行清洗。清洗应定期进行,如果在短期内分析许多样品,则以每日清洗一次为宜,至少也应周一次,防止有太多杂质在柱上堆积

反相柱的常规洗涤办法:分别取甲醇、三氯甲烷、甲醇-水各20倍柱体积(即对于一根4.6mm×25cm的柱来说,通常是50~60ml,而对于9.4mmx50cm的柱来说,通常是500~600ml),使之通过柱子。然后用流动相平衡(通常仍用20倍柱体积),柱一般将恢复正常。如果选择性仍和以前不一样,则表明还有其他杂质留在柱子里,这时应考虑更加严格地清洗先用20倍柱体积的水,再用相同体积0.05mol/L硫酸,最后用流动相溶剂、酸洗常能洗下有机溶剂所不能洗下的剩余杂质。在低pH值下做长期(一天或更长)清洗是不适宜的,但50mI洗液以2ml/min的速度清洗25min,一般对键合相没有损害。注意,强碱不能用来清洗任何微粒硅胶柱(不论是键合相还是非键合相),因为硅胶骨架会溶解。对严重污染的反相柱,只能采用再生的方法。

2.柱头塌陷的处理

拆下不锈钢烧结过滤器后,检查柱床,常可见柱头塌陷,此时先剔掉无规则床层和带色填料,使柱床呈白色并完全水平,再使甲醇作糊状填料匀浆液,将填料匀浆液滴在柱上靠重力从匀浆液中排出甲醇液,重复数次,直到水平,完成柱的再生。此时,如果柱头孔原深度小于1cm,可以采用下述局部重装的办法,否则,柱应当完全重装或更换。

柱入口局部重装时采用的填料可以和原填料一样,也可以用玻璃珠。粒径大于20μm的可用敲打充填法干装。如果粒径小于20μm则要用合适的溶剂配成匀浆,匀浆逐次加入,每次加入前都要使上一次加入的全部沉降。把孔隙填满后,用刮刀将填料刮平。更换柱入口接头,把柱重新接到液相色谱系统中,慢慢地增加流动相流速和系统压力,直到达到操作上限。让相当于10~20倍柱体积的流动相通过柱子,然后逐渐降低柱流速,并使压力降为零,再把柱子卸下来,并卸下入口接头,观察柱的入口。此时孔隙应当减小,但是由于新加入的填料在系统的操作压力下压入柱头,孔隙不可能一次被全部充满。重复上述局部重装过程,直到柱上加不进更多的填料为止。一旦柱子填充完毕,可加进混合样品,测定柱子的性能是否已经改善。

3.柱再生

色谱柱使用一段时间后,柱效将会下降,必须进行再生处理。再生处理包括活化(自右向左)和净化(自左向右)两种。对不同的填料处理方法不同,同一种填料也可以采用不同的处理方法。

硅胶、氧化铝和极性(正相)键合相色谱柱可以采用以下程序再生:三甲基戊烷或己烷三氯乙烷→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水,采用上述溶剂依次以1 ml/min的流速通过色谱柱,洗脱量约为20ml。然后反方向重复上述过程。

反相色谱柱常用甲醇—水或乙腈—水作流动相,有时还可能含有控制pH值的盐、酸或离子型溶剂。对硅胶或以硅胶为基质的键合(或离子交换)填料,为避免硅胶溶解,pH值不应超过8.5。再生时将25ml纯甲醇及25ml甲醇—氯仿(1:1)混合液依次通过色谱柱淋洗,然后用所选的流动相平衡。

离子交换色谱柱的再生方法有两种:

①先用25m蒸馏水通过柱子以除去所有的缓冲盐类:然后采用25ml甲醇冲洗柱子,以除去由于分配效应而残存在骨架中的杂质;再用25m蒸馏水除去不溶于甲醇的残存盐类:最后用缓冲液平衡。

②先用0.1mol/L的柠檬酸洗涤;然后用水洗涤(不要用碱性溶液,以防硅胶基质溶解);最后用缓冲液平衡。

如果柱头被污染,可以在出口处用输液泵反相压入溶剂,通常选用有一定黏度的溶剂(如甘油-水或水-甲醇),将填料从内慢慢推出少许,停泵,切除柱头已污染的填料,放入烧杯中清洗后,再重新装填,测定柱效至达到要求。

常见色谱柱再生用溶剂及其顺序见表5,带金属抗衡离子的聚合物色谱柱的再生方法见表6。

常见色谱柱再生用溶剂及顺序

固定相类型	再生溶剂及顺序
正相固定相	用四氢呋喃冲洗;甲醇冲洗;四氢呋喃冲洗;二氯甲烷冲洗;无苯正己烷冲洗
反相固定相	用HPLC级水冲洗,在冲洗过程中加入4等份200μl的二甲亚砜(DMSO);依次用甲醇、氯仿、甲醇冲洗
阴离子交换固定相	依次用HPLC级水、甲醇、氯仿冲洗
阳离子交换固定相	用HPLC级水冲洗,在冲洗过程中加入4等份200μl的DMSO;四氢呋喃冲洗
蛋白质凝胶固定相	去除蛋白质尺寸排阻介质中的污染物有两种清洗/再生的方法:①弱保留蛋白质,用30mol/LpH=3.0的磷酸盐缓冲液冲洗;②强保留蛋白质,用100%的水到100%的乙氰梯度洗脱60min

带金属抗衡离子的聚合物色谱柱的再生方法

色谱柱类型	金属污染物	有机污染物	色谱柱清洗
氢离子型	用25℃的0.1mol/LH₂SO₄溶液以0.1ml/min的流速反向洗4~6h	用25℃的20:80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗 4h	用65℃的20:80的乙氰0.01mol/LH₂SO₄溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4h
钙离子型	用25℃的0.1mol/LpH=6.3的Ca(NO₃)₂溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4~16h	用25℃的20:80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4h	用25℃的20:80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4h
钠离子型	用85℃的0.1mol/L的NaNO₃溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4~16h	用25℃的20:80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4h	用25℃的20:80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4h
银离子型	没有再生过程报道	用25℃的20:80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4h	用25℃的20:80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4h
铅离子型	用85℃的0.1mol/LpH=3.3的Pb(NO₃)₂溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4~16h	用25℃的20:80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4h	用25℃的20:80的乙氰水溶液以0.1ml/min的流速反向冲洗4h