Western Blot的过程与优化，着重于化学发光检测

实验步骤

一、蛋白质印迹法

蛋白质印迹 (Western Blotting) 法是在混合的复合物中鉴定和定量特定蛋白质的一种有效且常用的方法 (Towbin et al. ,1979)。这一技术对固定在硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯 (PVDP) 膜上的蛋白质样本进行非直接的检测。在常规的蛋白质印迹中，蛋白质样本首先通过 SDS-PAGE 进行分离，然后电转移到膜上。在用不相关的蛋白质封闭膜之后 ，用与靶抗原结合的一抗 (多克隆抗体或单克隆抗体) 与膜孵育。接着清洗膜，再用可与一抗发生反应的酶联二抗孵育。然后再次清洗膜，将其在合适的酶底物中孵育。如果使用比色底物的话, 信号可以目测，如果用化学发光和荧光底物，则 可 利 用 X 射线胶片或成像设备测得信号。

蛋白质印迹方法学中几个最重要的进步包括高灵敏度增强化学发光底物、成像系统和最近出现的多种见光稳定的荣光剂= 超尚灵敏度的化学发光底物 的广泛应用几乎取代了同位素标记的探针的使用。用¹²⁵I 标记的蛋白质 A 或蛋白质 G 曾一度广泛用做二级检测剂，但如今增强化学发光底物就可检测到低至飞克 (femtogram) 数量级的蛋白质，并且具有高信噪比。

电荷親合元件 (charged-coupled device，CCD) 成像仪在大多数实验室中都十分常见。成像仪具有较大动态范围和高程度曝光控制, 这使得背景信号能够自由调节。此外 ，成像仪所附带的分析软件能够完成光密度分析。尽 管 X 射线胶片仍然应用广泛且灵敏度更高，但 是 CCD 成像系统却可以避免处理胶片和显影的麻烦，并且也不会产生化学废物。

近 来 ，荧 光 剂 染 料 发 展 迅 速 ，这 要 归 功 于 新 一 代 荧 光 团 。与 传 统 荧 光 团 相 比 ，它 们 在亮 度 、光 稳 定 性 及 p H 灵 敏 度 上 有 着 巨 大 的 进 步 。通 过 荧 光 检 测 的 蛋 白 质 印 迹 检 测 法 通常 用 于 同 一 印 迹 中 需 要 检 测 两 种 不 同 靶 抗 原 时 。而 突 光 团 对 的 选 择 基 于 它 们 不 同 的 可 区分 开 的 激 发 -发 射 光 谱 。易 辨 别 的 颜 色 差 异 能 够 使 多 色 检 测 实 验 顺 利 完 成 。最 值 得 注 意的 是 ，这 些 新 型 荧 光 染 料 结 合 软 件 的 运 用 ，可 实 现 细 胞 信 号 通 路 的 检 测 和 定 量(Chou d h a r y et al ,2007；T i p s m a r k et al. ,2008)

二、蛋白质印迹法的种类

2.1 直 接 与 间 接

直 接 蛋 白 质 印 迹 法 是 指 利 用 标 记 报 告 系 统 的 一 抗 直 接 与 靶 蛋 白 结 合 。间 接 蛋 白 质 印迹 法 则 利 用 标 记 的 二 抗 (R a m L a U ，1987) 与 未 标 记 的 一 抗 相 结 合（图 33. I h 由 于 无 需 与二 抗 孵 育 ，直 接 蛋 白 质 印 迹 法 比 间 接 蛋 白 质 印 迹 法 耗 时 较 短 。此 外 ，直 接 蛋 白 质 印 迹 法 也避 免 了 因 二 抗 交 叉 反 应 所 造 成 的 背 景 信 号（Bergendahl et al. ,2003)。直 接 蛋 白 质 印 迹法 还 可 同 时 探 测 多 种 靶 物 质 。但 是 有 时 在 免 疫 反 应 中 , 标 记 一 抗 会 有 不 利 影 响 ，并 且 即 便在 最 好 的 情 况 ，标 记 过 的 一 抗 也 无 法 进 行 信 号 放 大 。因 此 ，直 接 蛋 白 质 印 迹 法 的 灵 敏 度 通常 要 低 于 间 接 检 测 法 ，并 且 只 能 在 靶 抗 原 丰 度 较 高 时 使 用 。能 够 放 大 信 号 并 不 使 用 二 抗的 间 接 检 测 法 称 为 一 抗 生 物 素 化 。用 生 物 素 化 的 试 剂 标 记 一 抗 通 常 使 每 个 抗 体 分 子 带 有超 过 一 个 生 物 素 。每 一 个 生 物 素 都 能 够 和 酶 联 的 亲 和 素 、链 霉 亲 和 素 或 T h e r m o Scientific NeutrAvidin Protein® 发 生 反 应 。这 些 多 酶 体 系 催 化 了 合 适 的 底 物 的 转 化 ，以 此 放 大信 号 。基 本 上 ，亲 和 素 偶 联 物 替 代 了 二 抗 , 并 且 其 物 质 的 量 浓 度 和 二 抗 原 本 的 物 质 的 量 浓度 几 乎 相 同 。但 是 需 要 注 意 , 如 果 用 于 凝 胶 中 的 样 本 是 天 然 生 物 素 化 的 ，尤 其 是 在 使 用 高灵 敏 度 底 物 时 ，产 生 的 信 号 很 有 可 能 会 干 扰 靶 蛋 白 的 检 测 。

2.2 far-Western

有 时 , 针 对 一 种 特 定 抗 原 的 抗 体 在 蛋 白 质 印 迹 分 析 时 并 不 适 用 ，或 者 无 法 获 得 。然而当 靶 蛋 白 结 合 物 可 充 当 探 针 时 ，印 迹 法 仍 然 可 行 。这 种 类 型 的 应 用 便 称 为 far-WestemBlot, 通 常 用 于 蛋 白 质 -蛋 白 质 相 互 作 用 的 发 现 或 确 认 。关 于 这 个 主 题 的 变 化 颇 多 ，并 涉及 前 文 所 述 的 所 有 方 法 策 略 。此 时 标 记 过 的 结 合 物 就 相 当 于 一 抗 , 可 通 过 与 35S 体 外 翻 译反 应 进 行 标 记 。也 可 以 将 探 针 生 物 素 化 ，并 用 亲 和 素 或 类 似 亲 和 素 的 偶 联 物 检 测 ，这样能够 更 好 地 放 大 信 号 。必 须 注 意 探 针 不 宜 过 度 标 记 ，因 为 这 会 减 弱 它 与 靶 物 质 的 反 应 能 力 。或 者 ，可 将 带 标 记 的 重 组 探 针 在 细 菌 中 表 达 (标 记 可 选 择 G S T 、H A 、c-M y c 或 F L A G ) ，通过 识 别 这 些 标 签 的 标 记 抗 体 实 现 检 测（Burgess et aL ,2000)。

2.3 半定量蛋白质印迹法

通 常 认 为 蛋 白 质 印 迹 法 是 定 性 的 ，但 当 加 入 特 定 对 照 时 ，它 也 可 成 为 一 种 定 量 方 法 。当 E L I S A 无 法 用 于 某 种 样 本 ，或 是 当 生 物 样 本 中 的 某 种 组 分 会 干 扰 E L I S A 时 , 半 定 量 蛋白 质 印 迹 法 便 表 现 出 其 优 势 。一 般 来 说 ，针 对 某 种 蛋 白 质 的 抗 体 也 能 对 与 这 种 蛋 白 质 密切 联 系 的 蛋 白 质 表 现 出 同 等 专 一 性 。在 这 种 情 况 下 ，E L I S A 会 产 生 假 阳 性 或 过 高 估 计 了
靶 蛋 白 丰 度 。 由 于 蛋 白 质 印 迹 法 需 要 用 凝 胶 电 泳 分 辨 蛋 白 质 ，分 子 质 量 间 的 差 异 可 以 用来 单 独 区 分 和 定 量 粑 蛋 白（Sato et al. ，2002;Xing and I m a g a w a , 1999)。

为 了 评 估 定 量 蛋 白 质 印 迹 法 的 有 效 性 和 准 确 性 ，我 们 要 用 纯 化 的 靶 蛋 白 作 为 内 对 照 ，绘 制 出 标 准 曲 线 。样 本 必 须 含 有 足 够 量 的 靶 蛋 白 ，使 其 量 控 制 在 标 准 曲 线 范 围 之 内 。可借 助 C C D 照 相 机 和 成 像 系 统 对 蛋 白 质 印 迹 进 行 光 密 度 分 析 ，将 条 带 强 度 转 化 为 定 量 尺度 。最 后 用 E L I S A 验 证 蛋 白 质 印 迹 法 测 出 的 曲 线 趋 势（M a t h r u b u t h a m and V a t t e m ，
2005)。

2.3.1 检 测 方 法

SuperSignal① W est Dura 底 物（Thermo Fisher Scientific) 检测信号。用 Kodak 20000 MM成 像 站 成 像 ，并 用 成 像 站 附 带 的 印 迹 密 度 分 析 软 件 分 析 蛋 白 质 条 带 密 度 。定量蛋白质印迹数据可通过 P5 3 和 的 ELISA 实验进行验证 (Assay Designs,
Arm Arbor ,M D，根据制造商说明书完成 ELISA。

2.3.2 结 果 及 讨 论

蛋 白 质 印 迹 的 光 密 度 分 析 表 明 ，L B a 的 线 性 范 围 为 0•097〜 3.12 n g ，p 5 3 的线性范围为 1. 87〜 60 n g 。在 这 个 范 围 内 提 供 了 极 佳 的 阳 性 内 对 照 ，并 能 抵 消 蛋 白 质 印 迹 法 效 率的 差 异 。

在蛋白质印迹分析中，在 用 E G F 处 理 后 的 前 5 m in 内 IkBc 1 的水平保持恒定，但在30 min 后迅速降低 3 0 % ，最后, 在接下来的 24 h 内逐渐上升（图 33.2)。蛋白质印迹光密度分析表明，P5 3 水平在用 D ox 处理后的前 8 h 变化很小，在 这 之 后 的 20〜30 h 迅速上升 。若 用 C is 处 理 ，p 5 3 水平则在 30 h 内逐渐上升 (数据未显示）。

LcBa ( 图 33.2 ) 和 P5 3 水 平 变 化 趋 势 可 用 E L IS A 验 证 ，并 和 已 发 表 的 数 据 一 致(K w ok et a l .，I 9 9 4 5Sun and Carpenter，1998)。在 p53 的实验 中 ，尽管通过蛋白质印迹法得出的数据已被 ELISA 所验证，但是，仔细比较这些数据可以发现，在 20〜30 h , 蛋白质印迹对 P 5 3 的数量变化更为灵敏。在 20〜30 h 存在着大量 P5 3 , 但 是 E L ISA 无法检测出这段时间中 P 5 3 正在逐渐增加，而蛋白质印迹法却可以做到。相 反 , 在 前 8 h 内，p 53
水平相对较低，E L IS A 比定量蛋白质印迹法更能较好地检测 p5 3 的变化。

虽然蛋白质印迹法和 E L IS A 同属免疫检测法，但其应用各异, 且通常所用的免疫试剂也有所不同。绝对蛋白质数量差异的产生大抵是因为用于对照组、一抗特异性的重组蛋白有所差异, 以及每种技术中蛋白质的相互作用各不相同。

三、检测方法

3.1 酶联物

碱性磷酸酶 (A P，l 4 0 kDa) 作为曾经的首选酶，通常可用做沉淀显色的底物。比色反应以稳定速率进行，这使相关灵敏度和反应进程能得到精确控制。随着蛋白质研究的发展 ，H R P(40 kDa) 变得更为流行，因其稳定性好，分子质量更小。这些特性就能使每个Ig G 结合更多的 H R P 分子 ，灵敏度也就更强。此 外 ，用 于 H R P 的化学发光底物还能进一步提 f t 灵敏度。

3.2 比色检测法

比色或显色底物或许是最简便也是最划算的检测方法。当与合适的酶接触时, 这些底物便转化为不溶的有色物质沉淀在膜上，无 需 特 殊设备便可处理或观测。底 物 ，如3 ，3’，5，5’-四甲基联苯胺 (TMB)、4-氯-1-萘酚 (4-CN) 和 3,3’-二氨基联苯胺盐酸盐 (DAB)与 H R P — 同使用。 A P 的底物包括会形成不溶浓紫色沉淀的 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸-P -甲苯胺盐 (BCIP)、氯化氮蓝四唑 (NBT) 和 Fast Red(萘酚 AS-M X 磷酸盐+ F a s t Red TR盐）。从不同供应商处购得的同种底物差异可能会很大, 这是因为底物的浓度和纯度、添加物及缓冲成分都会影响实验结果。

3.3 荧光检测法

借助荧光检测的蛋白质印迹法通常用于同一印迹中有两种不同靶物质和需要高灵敏度的实验中。荧光染料 (通常称为「荧光团」,即「fluorophore」或简称「fluor」) 是一种特殊分 子 ，它在某一波长吸收一个光子能量时化学键被激发，回到基态时能发射出一个波长大于吸收光的光子。化学性稳定, 具有合适范围的高效 (强烈) 激发和发射波长的小分子荧光团可用于检测抗体的化学标签或标记，以及其他生物分子探针。

一些基于荧光剂的系统使用荧光蛋白（如藻红蛋白）或生物发光报告系统，但是这些方法十分耗时，在检测多种靶物质时具有局限性, 并且通常不具有人工合成荧光染料那样的 光 稳 定 性 和 灵 敏 度 。利 用 精 选 的 荧 光 染 料 组 所 标 记 的 特 定 探 针 ，荧 光 技 术 实 现 了 多 种靶 物 质 的 探 测 , 并 适 用 于 更 多 型 号 的 荧 光 设 备 。

尽 管 荧 光 黄 、罗 丹 明 和 氨 基 甲 基 香 豆 素 乙 酸 盐 (A M C A ) 染 料 是 传 统 的 荧 光 团 ，它们者 IS 具 有 许 多 局 限 性 。特 别 是 这 些 传 统 染 料 具 有 相 对 较 低 的 荧 光 强 度 ，容 易 发 生 光 漂 白 。新 一 代 的 荧 光 团 克 服 了 这 些 局 限 性 (表 33. 1 ) ，并 且 在 亮 度 、光 稳 定 性 和 p H 灵 敏 度 方 面都 有 巨 大 的 改 进 。这 些 新 型 荧 光 团 可 覆 盖 整 个 可 见 光 谱 及 大 部 分 的 红 外 线 光 谱 。

当 进 行 焚 光 蛋 白 质 印 迹 实 验 时 , 通 常 选 择 弱 荧 光 (处 理 的 ) 膜 ，因 为 膜 聚 合 物 在 光 谱 可见 范 围 内 的 自 发 荧 光 会 对 检 测 造 成 干 扰 。鉴 定 靶 物 质 时 ，选 择 激 发 -发 射 光 谱 不 重 叠 的 荧光 剂 是 十 分 关 键 的 。一对 典 型 的 荧 光 剂 包 括 T h e r m o Scientific Dy L i g h t ① Fluors 549 和T h e r m o Scientific DyLight Fluors 649 或 是 D y Light Near-infrared (I R ) Fluors 680 和DyLight Near-infrared (I R ) FIuots 800。 近 红 外 线 荧 光 剂 十 分 有 用 ，因 为 蛋 白 质 样 本 和膜 聚 合 物 的 自 发 荧 光 不 太 可 能 出 现 在 这 些 光 谱 范 围 中 , 从 而 可 以 实 现 更 低 的 背 景 和 更 高的 灵 敏 度（Patonay and Antoine,1991;Sowell et al. ,2002)。

3.4 化学发光检测法

最 常 用 的 蛋 白 质 印 迹 法 底 物 是 基 于 鲁 米 诺 的 底 物 ，该 底 物 能 够 产 生 化 学 发 光 信 号 。化 学 发 光 是 一 种 能 够 产 生 光 形 式 能 量 的 化 学 反 应 (图 33. 3)。鲁 米 诺 在 H R P 和 过 氧 化 氢缓 冲 液 存 在 下 被 氧 化 ，形 成 一 种 处 于 激 发 态 的 产 物 , 从 激 发 态 衰 退 至 基 态 时 能 发 出 光 。光

四、化学发光信号

4.1 信号捕捉

虽然化学发光蛋白质印迹法十分常用，但是对于难于捕获的信号的捕捉却很棘手。蛋白质印迹法要用到一系列需要技巧的技术，因此许多因素都会导致无法捕捉到信号。由于变量较多 (表 33. 2)，问题印迹的问题诊断和排除就如同大海捞针一样困难。传统的方案在检测某一个蛋白质时通常都是无效的。例如 ， 一 抗可能无法识别变性状态下的固定化抗原。尽管在非变性环境下蛋白质可保持天然状态，但这却使得目标蛋白质分子质量的确定更具挑战。此外，超大型或疏水蛋白质通常会阻碍有效的膜转移。另外，小型蛋白质 (小于等于 10 kDa) 会从膜孔中穿出，无法与膜结合。因此, 为确保能够用于检测靶物质，Towbin 的原始方案一再被修改。这些修改包括使用不同的试剂进行间接检测或 4标记的一抗进行直接检测。有时可以完全跳过转移这一步骤，在凝胶内完成检测（Desaiet al.,2001)。

体 持 续 时 间 取 决 于 所 使 用 的 特 定 底 物 。产 生 了 多 少 光 、这 些 光 能 持 续 多 久 , 则 取 决 于 具 体使 用 的 底 物 以 及 系 统 中 酶 与 底 物 之 间 的 比 例 。尽 管 用 于 一 个 印 迹 的 底 物 量 相 对 恒 定 ，呈现 的 酶 的 数 量 却 和 添 加 量 以 及 其 他 因 素 有 关 (见 表 33.1)。在 蛋 白 质 印 迹 系 统 中 ，酶 联 物过 多 是 导 致 信 号 易 变 、背 景 太 深 、信 号 持 续 时 间 短 及 灵 敏 度 低 的 单 一 的 最 主 要 的 原 因 。

最 理 想 的 信 号 发 射 曲 线 是 缓 慢 衰 减 的 (图 33. 4 ) , 因 为 这 表 明 系 统 中 的 每 一 组 分 都 达到 了 最 优 化 ，并 能 产 生 可 重 复 的 结 果 。信 号 衰 减 的 太 快 会 造 成 差 异 ，使 得 灵 敏 度 低 及 信 号记 录 不 足 。持 续 时 间 长 的 信 号 能 最 大 限 度 减 小 因 转 移 效 率 、底 物 制 造 商 批 次 和 其 他 因 素造 成 的 差 异 。

虽 然 H R P 在 底 物 存 在 的 情 况 下 能 保 持 活 性 ，但 是 随 着 和 底 物 接 触 时 间 的 延 长 , H R P也 会 失 活 。在 氧 化 反 应 中 产 生 的 自 由 基 可 与 H R P 结 合 ，这 种 方 式 让 酶 无 法 再 与 底 物 反应 。系 统 中 过 量 的 H R P 也 会 产 生 大 量 的 自 由 基 ，这增 加 了 H R P 失 活 的 可 能 性 。 自由基还 会 破 坏 抗 原 、抗 体 和 膜 ，降 低 膜 再 标 记 的 有 效 性 。

4.3 蛋 白 廣 印 迹 的 优 化

每 一 个 蛋 白 质 印 迹 系 统 都 必 须 经 过 优 化 以 获 得 一 致 的 实 验 结 果 。许 多 因 素 都 会 影 响信 号 的 强 度 和 持 续 时 间 , 每 一 种 因 素 都 可 被 优 化 , 我 们 将 在 以 下 几 节 中 讨 论 。本 章 末 尾 关于 方 案 的 一 节 包 括 了 优 化 步 骤 的 具 体 指 导 和 建 议 。

4.3.1 印迹膜

膜 组 分 似 乎 不 能 影 响 H R P -鲁 米 诺 反 应 以 及 后 续 的 信 号 产 生 。然 而 ，硝 酸 纤 维 素 膜和 P V D F 膜 的 确 在 蛋 白 质 结 合 特 性 上 有 所 不 同 。一 般 来 说 ，硝 酸 纤 维 素 膜 能 更 好 地 与 蛋白 质 结 合 ，条 带 更 清 晰 ，有 时 候 灵 敏 度 也 更 高 。而 P V D F 膜 疏 水 性 更 强 , 不 易 浸湿 ，有 时会 产 生 更 多 背 景 信 号 ，然 而 ，它 具 有 较 大 的 抗 张 强 度 和 良 好 的 操 纵 特 性 。为 获 得 最 好 的 实验 结 果 ，需 要 根 据 经 验 来 确 定 蛋 白 质 印 迹 系 统 最 优 化 的 膜 类 型 、制 造 商 和 批 次 。一旦 证 明某 种 膜 在 系 统 中 有 效 ，最 好 在 整 个 研 究 过 程 中 都 使 用 这 一 批 次 的 产 品 。

4.3.2 靶蛋白

不 同 蛋 白 质 的 转 移 效 率 有 着 很 大 不 同 。在 特 定 的 设 置 的 条 件 下 ，蛋 白 质 迁 出 凝 胶 的能 力 及 结 合 膜 的 向 有 所 不 同 。转 移 效 率 依 赖 于 一 定 因 素 ，如 凝 胶 组 分 、凝 胶 与 膜 的 接 触程 度 、电 极 的 位 置 、转 移 的 持 续 时 间 、蛋 白 质 大 小 和 组 分 、电 场 强 度 及 是 否 加 人 去 污 剂 。低离 子 强 度 缓 冲 液 和 低 电 流 的 条 件 可 使 大 多 数 蛋 白 质 达 到 最 优 转 移 。使 用 与 免 疫 印 迹 相 兼容 的 或 可 逆 的 染 料 对 膜 进 行 染 色 ，可 评 估 转 移 效 率 (Sasse and Gallagher, 2008)。用 于 膜染 色 的 一 些 常 见 蛋 白 质 染 料 包 括 : 丽 春 红 S ,— 种 可 随 时 间 褪 色 的 红 色 染 料 ; 考 马 斯 染 料 ，一 种 可 紧 密 结 合 蛋 白 质 并 干 扰 免 疫 印 迹 的 敏 感 的 蓝 色 染 料 ,— 种 简 单 可 逆 的 蓝 色 染 料（Antharavally et al. ，2004)。

4.3.3 封闭缓 冲 液

很 多 不 同 的 封 闭 试 剂 都 对 蛋 白 质 印 迹 有 效 。因 为 没 有 任 何 一 种 封 闭 剂 适 用 于 所 有 系统 ，故 有 必 要 进 行 检 验 (Spinola and C a n n o n ，1985)。理 想 的 封 闭 缓 冲 液 具 有 最 大 的 信 噪比 ，而 且 不 会 与 系 统 中 的 抗 体 或 靶 物 质 反 应 。例 如 , 在 亲 和 素 -生 物 素 系 统 中 使 用 5 % 脱脂 牛 奶 作 为 封 闭 剂 可 造 成 高 背 景 ，因 为 牛 奶 中 含 有 不 同 量 的 内 源 生 物 素 , 可 与 亲 和 素 蛋 白结 合 。当 变 换 底 物 、抗 体 或 靶 物 质 时 ，仅 仅 因 为 对 于 这 一 新 系 统 封 闭 缓 冲 液 不 再 是 最 理 想的 , 就 可 能 引 起 信 号 减 弱 或 背 景 增 强 。

在 封 闭 缓 冲 液 中 加 人 表 面 活 性 剂 ，如 去 污 剂 T W e e n -20，可 为 某 些 系 统 带 来 好 处 。表 面 活 性 剂 阻 止 封 闭 试 剂 与 靶 物 质 的 非 特 异 结 合 ，或 将 膜 上 抗 体 可 以 结 合 的 疏 水 位 点 封闭 , 从 而 使 背 景 最 弱 化 。然 而 ，加 入 过 多 的 去 污 剂 会 造 成 封 闭 不 充 分 。通 常 我 们 使 用 终 浓度 为 〇. 0 5 % 的 去 污 剂 。但 是 ，为 了 得 到 最 好 结 果 , 我 们 要 确 定 去 污 剂 是 否 增 强 了 某 个 特殊 系 统 及 确 定 去 污 剂 的 理 想 浓 度 。通 常 使 用 高 质 量 低 污 染 的 去 污 剂 。

4.3.4 抗体

不 只 是 作 用 于 抗 原 的 一 抗 的 亲 和 力 很 重 要 , 一 抗 和 二 抗 浓 度 同 样 对 信 号 强 度 有 很 大影 响 。一 抗 或 /和 二 抗 浓 度 不 当 会 造 成 印 迹 上 H R P 过 多 。采 用 最 小 一 抗 浓 度 比 较 有 利 ，因 为 这 样 能 推 动 靶 物 质 的 特 殊 结 合 并 降 低 背 景 。

如 果 印 迹 不 能 产 生 足 够 的 信 号 ，就 将 所 有 的 检 测 试 剂 从 印 迹 中 移 除 (剥 离），并 使 用 不同 的 一 抗 或 不 同 的 抗 体 浓 度 重 新 标 记 ，这 种 做 法 常 常 可 以 节 约 珍 贵 的 样 品 ，并 且 节 省 时间 ; 然 而 ，不 充 分 的 剥 离 可 使 有 活 性 的 H R P 残 留 在 印 迹 上 并 产 生 信 号 。将 底 物 加 在 被 剥离 的 印 迹 上 , 随 后 便 可 检 测 出 印 迹 上 是 否 残 留 活 性 H R P 。 同 样 , 剥 离 无 法 移 除 的 大 量 失活 H R P 分 子 会 抑 制 一 抗 与 靶 物 质 的 结 合 。剥 离 并 重 新 标 记 印 迹 是 一 种 获 得 特 殊 系 统 相关 信 息 的 有 效 方 法 ，但 并 不 是 一 种 确 定 理 想 系 统 参 数 的 决 定 性 方 式 。

4.3.5 检 测 方 法

习 惯 上 ，使 用 胶 片 来 检 测 蛋 白 质 印 迹 的 化 学 发 光 信 号 。它 不 需 要 昂 贵 的 设 备 ，并 能 提供 极 佳 的 灵 敏 度 ，但 却 只 有 狭 窄 范 围 的 线 性 检 测 强 度 。通 常 需 要 调 整 胶 片 的 曝 光 时 间 以得 到 具 可 出 版 质 量 的 印 迹 结 果 ，这 会 消 耗 时 间 并 造 成 浪 费 。将 曝 光 后 的 胶 片 浸 泡 在Thermo Scientific Reagents 系 列 产 品 中 可 以 移 除 曝 光 过 度 产 生 的 额 外 信 号（图 33.5 ) 。这 些 试 剂 可 以 均 匀 地 移 除 胶 片 中 的 银 ，在 优 化 胶 片 表 观 的 同 时 维 持 信 噪 比 。

C C D 照 相 机 及 附 带 的 分 析 软 件 可 以 调 整 背 景 水 平 并 完 成 密 度 测 定 。与 胶 片 相 比 ，成像 仪 在 检 测 方 面 具 有 一 定 优 势 ，因 其 有 较 大 的 动 态 范 围 和 高 程 度 的 曝 光 控 制 ，可 在 没 有 高背 景 或 高 强 度 信 号 干 扰 数 据 的 情 况 下 尽 可 能 地 完 成 图 像 记 录 。此 外 , 理 想 的 曝 光 时 间 可防 止 条 带 信 号 饱 和 , 并 能 观 察 到 密 度 的 微 小 变 化 。相 比 较 而 言 ，胶 片 具 有 较 小 的 动 态 范围 ，条 带 信 号 也 会 迅 速 达 到 饱 和 。当 信 号 强 度 较 高 时 ，胶 片 的 低 动 态 范 围 使 其 快 速 饱 和 ，并 且 曝 光 控 制 的 局 限 性 通 常 会 产 生 过 度 曝 光 的 图 像 。

五、常见问题及其原因

5.1 没 有 信 号

初 次 曝 光 时 未 捕 获 到 化 学 发 光 信 号 , 表 明 该 蛋 白 质 印 迹 系 统 需 要 优 化 。通 常 , 信 号 缺失 由 系 统 中 酶 量 (即 HRP) 过 多 造 成 。当 信 号 不 能 被 检 测 到 时 ，采 用 更 少 量 的 酶 联 物 似 乎有 违 我 们 的 直 觉 。然 而 ，若 要 得 到 成 功 的 信 号 记 录 ，酶 和 底 物 量 的 恰 当 平 衡 是 必 要 的 。酶催 化 的 底 物 氧 化 是 不 可 逆 的 ，因 此 , 一 旦 底 物 被 氧 化 , 就 不 能 再 与 酶 反 应 而 发 光 。 因 为 酶活性持续存在，底物就成了限制性因素，并且一旦底物耗尽，信号输出就终止了。在活性酶量不足的情况下发生信号缺失是很少见的。蛋白质印迹系统中的任何因素都会造成酶量过多或不足。

为了产生能够被捕获的信号，需要调整系统参数。制备新凝胶并使用较少样品或滴定抗体能获得可重复的结果。当优化抗体浓度时，需要对印迹成像两次: 第一次在加人底物后立即进行; 第二次在孵育底物一段时间后（如 I h ) 进行。第二次检测能提供理想酶浓度的相关信息，并有助于优化参数。

并且，如果初次曝光未捕获到信号，则在底物中进行二次孵育可能会产生信号 (若一些 H R P 仍有活性）。将所有的检测试剂从印迹中剥离并再标记印迹可以在优化参数的同时节省珍贵的样品。在底物中进行一次额外的孵育并剥离印迹仅仅只能再次获取系统的一些相关信息。如果想要了解印迹与印迹之间的一致性和对比性, 就必须在每一次实验中采用相同的条件和相同的步骤。

5.2 信 号 快 速 消 失

当一个特定系统产生的化学发光信号会快速消失时，需要根据前述方法对蛋白质印迹系统做一些优化。好消息是可以获得信号，表明此次印迹已经有所优化。有些时候尽管所有的参数都是相同的，但特定系统依然会产生比通常消失得更快的信号。系统全面优化后会将这一类型的结果最小化。原方法经内部的轻微改动，就能得到虽不是最优化但却也能获得成功的系统，如转移效率以及在保存和操作过程中样品及抗体活性的改变。

5.3 背 景 过 强

产生高背景信号的原因可能是封闭不充分, 抗体与封闭蛋白质发生了交叉反应，或是使用了过量的酶联物。有时研究人员认为某种特定的底物能产生背景或增强背景。这种底物通常在酶不存在时自身无法产生信号。当使用比先前更为敏感的底物时，如果不调整参数以补偿底物灵敏度，就会产生高背景。采用最适浓度的抗体将会促进其对靶蛋白的特异结合并产生低背景。

5.4 新 的 底 物 无 法 产 生 信 号

有时 ，某个特定系统中唯一发生改变的变量为一瓶新的或批号不同的底物时，可能无法捕获到信号。通常 ，该结果是由尚未完全优化的蛋白质印迹系统造成的。蛋白质印迹的底物本身就是可变的。许多制造商仅仅控制最小灵敏度，这使得新底物可能比先前使用的批次的更加敏感。在全面优化的印迹系统中, 底物敏感度的变化和其他的变量一样，都是微小或不显著的。

5.5 膜 上 呈 现 棕 色 或 黄 色 条 带

当 H R P 被氧化和失活时会呈现棕色。一定量的酶联物中，总是会有一部分被氧化。在优化后的系统中，被 氧 化 的 H R P 的量极小并无法从印迹上观察到。黄色或棕色条带的出现表明有大量的 H R P 存 在 ，因而被氧化和失活的部分是可见的。会产生黄色带的印 迹 系 统 需 要 通 过 可 采 用 更 少 量 的 酶 联 物 进 行 优 化 。此 外 ，过 多 H R P 在 某 一 局 部 位置 时 ，则 会 在 酶 活 作 用 下 产 生 大 量 自 由 基 。 自 由 基 会 使 H R P 失 活 ，并 破 坏 抗 体 、靶 抗 原
和 膜 ，抑 制 有 效 的 再 标 记 。

5.6 条 带 或 整 个 印 迹 在 暗 室 发 光

若 底 物 孵 育 后 的 条 带 或 整 个 印 迹 发 光 ，可 认 为 系 统 中 存 在 过 多 的 H R P 。该 现 象 表 明H R P 连 接 的 二 抗 需 要 进 一 步 稀 释 ，并 且 可 能 的 话 一 抗 也 要 稀 释 。蛋 白 质 印 迹 系 统 中 涉 及的 许 多 因 素 都 可 以 引 起 酶 量 过 多 。若 整 个 印 迹 都 在 发 光 ，那 就 很 有 必 要 对 封 闭 和 清 洗 也进 行 优 化 。

5 .7 假 带 / 空心带

那 些 成 晕 轮 状 (条 带 中 间 无 信 号 ) 或 黑 色 背 景 下 整 个 条 带 都 显 白 色 的 蛋 白 质 条 带 通 常被 称 为 假 带 。 白 色 区 域 内 底 物 耗 尽 时 就 会 导 致 这 一 结 果 的 发 生 。

我 们 并 不 明 确 假 带 产 生 的 特 殊 原 因 。因 此 ，我 们 检 测 了 几 种 能 够 造 成 这 一 结 果 的 因素 。我 们 会 在 下 面 章 节 中 简 要 描 述 研 究 结 果 , 下 述 章 节 会 反 映 一 些 常 见 引 起 假 带 效 果 的原 因 ，包 括 在 凝 胶 中 加 人 了 过 多 的 靶 蛋 白 ，以 及 使 用 了 会 与 封 闭 液 组 分 发 生 交 叉 反 应 的 抗体（V a t t e m and M a t h r u b u t h a m ,2005)。

5.7.1 分析方法

间 的 底 物 孵 育 会 延 长 信 号 持 续 时 间 。使 用 W e s t P i c o 或 W e s t D u r a 底 物 能 检 测 到 低 至10 n g 的 蛋 白 质 , 甚 至 在 完 成 蛋 白 质 印 迹 的 64 h 后 依 然 可 以 检 测 到 信 号 。 W e s t D u r a 比W est P ic o 的 底 物 更 敏 感 和 持 久 。尽 管 W e s t D u r a 在 检 测 5 n g 蛋 白 质 时 能 产 生 极 强 信号, 但泳道中含量超过 100 n g 会 导 致 信 号 迅 速 消 失 ，这 强 调 了 局 灵 敏 度 检 测 系 统 下 米 用适 量 靶 蛋 白 的 重 要 性 。

通 常 用 脱 脂 牛 奶 溶 液 孵 育 印 迹 以 最 小 化 背 景 信 号 。改 变 封 闭 液 中 牛 奶 的 浓 度 不 会 产生 假 带 。 令 人 吃 惊 的 是 ，封 闭 液 中 含 0 . 5 % 脱 脂 牛 奶 可 以 增 强 低 丰 度 蛋 白 质 的 检 测(图 33. 7A ); 然 而 ，抗 体 同 封 闭 蛋 白 质 的 交 叉 反 应 确 实 会 引 起 假 带 。如 果 一 抗 或 二 抗 同牛 奶 蛋 白 质 相 结 合 ，这 些 封 闭 的 位 点 化 学 发 光 ，产 生 深 色 背 景 ，而 样 品 蛋 白 质 集 中 于 膜 表面 ，形 成 白 色 条 带 (图 33. 7B )。

高 浓 度 的 酶 联 二 抗 与 大 量 靶 蛋 白 结 合 时 会 增 强 底 物 的 催 化 作 用 ，从 而 导 致 信 号 迅 速消 失 ，使 这 些 区 域 内 的 底 物 迅 速 耗 尽 。膜 上 转 移 的 大 量 蛋 白 质 可 与 大 量 H R P 连 接 的 二抗 相 结 合 。这 些 免 疫 复 合 物 集 中 区 域 内 产 物（也 就 是 信 号）的 过 度 产 生 会 使 底 物 迅 速 耗尽 ，造 成 假 带 。总 之 ，凝 胶 过 量 上 样 、二 抗 浓 度 过 高 、底 物 孵 育 未 达 到 最 优 化 的 时 间 ，以及抗 体 与 封 闭 区 的 交 叉 反 应 均 可 引 起 假 带 。在 使 用 髙 灵 敏 度 检 测 系 统 时 ，优 化 蛋 白 质 印 迹参 数 对 于 防 止 假 带 的 产 生 是 极 其 至 关 重 要 的

六、使用化学发光底物的印迹法和操作规程的优化

6.1 使 用 化 学 发 光 底 物 的 蛋 白 质 印 迹 法

(1) 凝胶电泳分离蛋白质样品。

(2) 制备转移缓冲液。采 用 4 〇 0 m L 超 纯 水 制 备 Tris— 甘氨酸转移缓冲液，再加人IOOmL 甲醇。 4°C 下 使 用 和 保 存 该 转 移 缓 冲 液 。注 ： 转 移 缓 冲 液 ： 25 mm 〇 I/LTris、192 mmol,L 甘氨酸 (pH8_ 0),2 0 % 甲醇。

(3) 为湿转移制作凝胶「三明治」(图 33.8)。对于半干的转移，在阴极和阳极间按同样的步骤制作三明治。， : 在三明治装配前将衬垫和滤纸浸泡在转移缓冲液中。

⑷将蛋白质从滅胶转移到膜上。湿转移时如果使用为 g cmX1 〇 c m 凝设计的迷你转移装置，则 40 V 转 移 90min, 并保持缓冲液温度为4 ℃ 。半干型转移时,15 v 转移90 min。注: 通过凝胶染色或膜可逆染色来确定转移是否成功。

(5) 取下膜』 在封闭缓冲液中室温 (R T ) 摇晃孵育 2 〇〜60 min ，以封闭膜上的非特异结合位点。

(6) 用 含 1 0 % 封闭液的一抗溶液孵育膜并振摇丄 h 。如果需要的话将印迹在 2〜8℃过夜孵育。

(7) 清洗 膜 3 次 ，每 次 5 min』 可 用 Tris-盐缓冲液 (TBS)、磷酸盐缓冲液 (pBS 域 其 他

(9) 清 洗 膜 5 次 ，每 次 5 m in 以除去未能结合的酶联物。酶联物孵育后彻底清洗膜是至关重要的。

(10) 制备底物。使用足量底物以确保膜完全浸湿 (0.1 mL/cm2), 且膜不能变干。

(11) 用电化学发光 (ECL) 孵 育 膜 I m in, 或 使 用 SuperSignal 底物孵育 5 m in。

(12) 将膜从底物中移出并放置在塑料片保护器内。尽管塑料保鲜膜也能起作用，但是硬质的塑料片做成的保护器作用更好。移除所有在膜和膜保护器表面之间的气泡。

(13) 通过胶片或冷 CCD 照相机进行印迹成像。

6.2 蛋白质印迹去除方案

采 用 化 学 发 光 底 物 的 众 多 好 处 之 一 个 就 是 能 够 移 除 所 有 检 测 试 剂（Kaufmannet al.,1087)。这些移除方法对于沉淀底物是无效的，并且用于荧光染料显色的膜时结果各异。

(1) 制备蛋白质印迹膜剥离液。使用下述剥离液中的一种：

① Restore W estern Blot Stripping Buffer(Therm o Fisher Scientific 公司产品）

② 0•I m o l / L 甘氨酸- H C K p H 2. 5〜3. 0);

③ 50 m m o l / L Tris-H C l (p H 7 ) 、2 % S D S 、50 m m o l / L D T T 。 注 : 现 配 现 用 。

(2) 将待除去印迹的膜放在蛋白质印迹剥离液中。使用足量溶液确保膜完全潮湿(每 8 c m X 10 c m 膜对应约 20 m L 剥离液)。注: 可能会出现一些靶蛋白的变性和损失。

(3) 室温孵育 5〜15 m in。为追求最佳结果，需要优化孵育时间和孵育温度。某些相互作用至少需要 15 m in, 可能还需要 37°C 孵育 。如果使用缓冲液③,70°C 孵 育 30 m in。

(4) 将印迹从蛋白质印迹膜剥离液中移出，用洗涤缓冲液清洗 (P B S / T B S 或其他含有 0.0 5 % T w e e n - 2 0 的生理缓冲液）。

(5) 要测试酶联物和一抗是否完全移除, 可进行下列实验。若两种情况下都能检测到信号，就重复步骤 (2)〜(4)，剥离时间额外增加 5〜15 m in 或 将 温 度 提 高 至 37°C 。优化去除时间和温度以确保在不损伤抗原的同时将抗体完全移除

① 要测试酶联物是否完全移除, 将膜用底物孵育并印迹成像。 5 m m 胶片曝光后若没有信号被检测到，那么表示酶联物已经被成功移除。

② 要测试一抗是否完全移除，将膜用酶联物赙育并用洗涤缓冲液清洗。再用底物孵育并印迹成像。 5 m in 胶片曝光后若没有信号被检测到，那么表示一抗已经被成功移除。

确定膜已经恰当地剥离以后, 开始进行第二次检测实验。通常，印迹可以被剥离和再检测数次, 但可能会需要更长的曝光时间或更敏感的底物。如果抗原不稳定, 之后的再检测可能会导致信号衰减。需要对单独系统进行分析。注: 剥离后通常不需要再次封闭薄膜 ，但在某些系统中却需要这么做。

6.3 抗 原 來 度 的 优 化

(1) 用 SDS^ A G E 样品缓冲液制备不同浓度的蛋白质样品。测试较大范围的蛋白质浓度，需要注意所使用底物的检测极限。

(2) 凝胶中每种浓度的样品要等量，通过电泳进行分离。将样品转移到膜上。

注 ： 最佳浓度的粗指示可使用点印迹。使用尽可能少的量将抗原稀释物点在干燥膜条上。使膜干燥 5〜10 m in 或直到没有可见潮湿痕迹，再进行步骤 (3)。

(3) 用标准封闭试剂封闭膜，加入一抗, 随后将酶联物结合膜。如果还没有确定最优稀释度，就根据底物敏感度采用中等范围的稀释度。

(4) 清洗膜，加入底物。按要求进行印迹成像。

6.4 膜 封 闭 的 优 化

(1) 用电泳分离蛋白质样品并转移至膜上，或如先前所述将蛋白质样品点在膜上。

(2) 根据待测试的条件的个数，将膜条从膜上切下来。下述组合物应该用每一种封闭剂测试。①封闭剂+ —抗 + 酶联物+ 底 物 ；② 封 闭 剂 + 酶 联 物 + 底 物 ；③ 封 闭 剂 +底物。

(3) 将膜条加入到各种封闭液中, 确保其完全浸泡在溶液中。每个膜条都室温振摇孵 育 I h 。

(4) 在各组中加入含 10% 封闭剂的一抗和/或酶联物。如果还没有确定最优稀释度，就 根 据 底 物 敏 感 度 采 用 中 等 范 围 稀 释 度 。

(5) 清 洗 膜 ，加 入 底 物 。按 要 求 进 行 印 迹 成 像 。

注 ：将 封 闭 后 的 膜 用 底 物 孵 育 , 以 检 査 封 闭 剂 或 样 品 中 内 源 的 过 氧 化 酶 活 性 。如 果检 测 到 信 号 ，就 在 封 闭 步 骤 后 使 用 其 他 的 封 闭 缓 冲 液 或 使 用 过 氧 化 酶 抑 制 剂 。封 闭 缓 冲液 用 量 大 时 会 最 大 限 度 地 减 少 非 特 异 信 号 。

6.5 — 抗 农 度 的 优 化

( 1 ) 电 泳 分 离 蛋 白 质 样 品 并 转 移 到 膜 上 。或 者 ，如 本 章 6. 3 节 所 述 将 蛋 白 质 样 品 点在 膜 上 。用 适 当 封 闭 剂 封 闭 膜 。根 据 待 测 试 的 一 抗 条 件 的 个 数 将 膜 条 从 膜 上 切 下 来 。

(2) 在 含 1/10 体积封闭剂的清洗缓冲液中制备一抗的稀释液，并将其加人到膜条上 。室温孵育 I h。

(3) 清 洗 膜 条 ，室 温 下 用 酶 联 物 孵 育 l h 。再 次 清 洗 并 用 适 当 的 底 物 显 现 信 号 。用 胶片 或 C C D 照 相 机 检 测 信 号 。

注 ：先 用 一 抗 工 作 液 孵 育 膜 ，再 用 酶 联 物 工 作 液 孵 育 ，以 检 查 一 抗 与 封 闭 剂 的 非 特 异性 结 合 。如 果 观 察 到 信 号 ，通 过 使 用 其 他 的 封 闭 剂 或 较 少 量 的 一 抗 来 解 决 此 问 题 。

6.6 膜 清 洗 的 优 化

⑴ 使 用 洗 涤 缓 冲 液 ，如 P B S 或 T B S 或 其 他 含 0. 05% tween2 0 的 生 理 缓 冲 液 。

(2) — 抗 孵 育 后 , 振 摇 清 洗 膜 至 少 3 次 , 每 次 5 m m ; 酶 联 物 孵 育 后 ，振 摇 清 洗 膜 至 少 5次 ，每 次 5 m i n 。

(3) 如 果 在 最 终 检 测 中 出 现 非 特 异 性 背 景 ，使 用 更 大 量 的 洗 涤 缓 冲 液 或 增 加 每 次 清洗 的 用 量 和 时 间 。如 果 仍 没 有 改 善 , 问 题 就 在 于 其 他 变 量 。

6.7 酶 联 物 农 度 的 优 化

当检测一个新的蛋白质印迹系统的最佳浓度时， 一 个简单的实验通常可以补救许多因信号变动带来的问题。

(1) 在 3 个 (或更多) 凝胶孔中加入同样用量的目标物。

(2) 电泳分离蛋白质样品并转移到膜上。封闭非特异结合位点，结合一抗。

(3) 清洗后，将含目标物的印迹切成膜条。

⑷以不同酶联物浓度结合膜条。例如，X 寸于 SuperSignal West Pico Substrate 使用1 : 40 000、1 : 60 000 和 1 : 80 000 的稀释度 (取自 I mg/mL 储备液）。室温下振摇孵育条 带 I h。

(5) 清洗膜条，加入底物。底物孵育后，进行膜条成像。

(6) 等 待 1〜2 h，再次进行膜条成像。

(7) 结果评估。选取能产生最强信号的稀释度。

6.8 检 测 方 法 的 优 化

(1) 电泳分离蛋白质样品并转移到膜上，或 如 本 章 6. 3 节描述将蛋白质样品点在膜 上 。

(2) 封闭非特异结合位点，在 含 有 1/10 封闭剂的体系中结合一抗和酶联物。

(3) 如果抗体浓度尚未优化，选择一个中等范围的稀释度。每次孵育后都要清洗膜。

(4) 根据待测试的底物曝光条件的个数从膜上切下膜条。制备待测试的底物工作 液 。

(5) 以制造商说明为准，用底物孵育膜条一段时间。

(6) 用镊子将底物中的膜条移出，在纸巾上轻拍条带边缘以移除过剩的底物。

(7) 将膜条放在塑料薄膜上, 按不同时间长度对其成像。选取一个有清晰信号和低背景的时间。注:CCD 照相机可能比胶片需要稍长的曝光时间。

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