PCR疑难问题解答第二篇：荧光定量PCR（二）
在qPCR 技术中重要的参数指标有哪些？
扩增及溶解曲线：扩增曲线是PCR过程中，以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的曲线。主要用于反映qPCR的动态进程；溶解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，溶解曲线就会出现单峰，如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个峰。
荧光域值（threshold）: 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。
Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。将已知浓度的标准品梯度稀释进行qPCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。
扩增曲线一般分为哪几个阶段
荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。在qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期，
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入平台期，在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
ROX染料是什么作用？
ROX（Passive Reference Dye）是一种惰性参比染料，在qPCR反应中能被qPCR仪检测到。ROX不参与qPCR反应，荧光信号值不会随着qPCR扩增而改变。实验过程中很多因素会引起孔间差异：不均匀的照明，孔与孔之间光学因素（液滴、气泡）的因素，反应体系的浓度不同…… 可以用ROX作为阳性参比，对其他荧光信号进行归一化校正，以提高数据的精确度。
Ct值多少才算理想
一般来说Ct值在30以下都可以说实验结果是可靠的，30以上基本可以说明该基因没有扩增，但也不是绝对的，需要辅以溶解曲线加以解释。
*** qPCR 常见问题分析 ***
| 问题类型 | 原因分析 |
| 无Ct值出现 | * 检测荧光信号的步骤有误：一般染料法采用72℃延伸时采集，探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号； * 引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性； * 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起； * 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况 |
| Ct 值出现过晚（Ct>38） | * 扩增效率低：反应条件不够优化，设计更好的引物或探针、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等； * PCR各种反应成分的降解或加样量不足； * PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度 |
| 标准曲线线性关系不佳 | * 加样存在误差：使得标准品不呈梯度； * 标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品 * 引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针； * 模板中存在抑制物，或模板浓度过高 |
| 扩增曲线异常，比如 S 型曲线 | * 参比染料设定不正确：预混液不加参比染料时，选NONE； * 模板的浓度太高或者降解； * 荧光染料的降解 |
| 负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰 | * 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现 * 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比 * 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒； |
| 扩增效率低 | * 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解； * 反应条件不够优化：可适当降低退火温度； * 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响 |
