OsAGAP mRNA原位杂交
实验概要
本实验以OsAGAP mRNA为试材介绍了原位杂交技术，包括：原位杂交正义、反义探针制备，原位杂交探针半定量，植物材料的固定与石蜡包埋，切片与粘片，杂交和显色等过程。
实验步骤
1. OsAGAP原位杂交正义、反义探针制备
对OsAGAP cDNA全长在GenBank中做BLAST分析，选取特异性最强的片段(767bp-987bp)用于探针制备，据此设计5’端引物：5’-CTC TCA AAC TGC AAGCGT-3'；3’端引物：5’-CAG CTC CTG CCT CAC CT-3'。将利用这对引物扩增到的OsAGAP(767bp-987bp)片段，分别以正向和反向连接到T easy载体上，用于探针制备。
利用DIG T7/SP6 Labeling kit ( Roche)来完成正义和反义探针的的高辛标记，反应程序依据其用户手册。正义、反义探针分别采用T7、SP6 RNA polymerase进行标记。取线性化的质粒模板1ug，加入DEPC处理的双蒸水至13ul；管中加入：
10 X NTP labeling mixture 2ul；
10 X Transcription buffer 2ul；
RNase inhibitor 1ul；
T7/SP6 RNA polymerase 2ul。
轻柔混匀后，37℃，温育2hr；加入2ulRNase-free的DNase15min，去除DNA模板；37℃，温育电泳确定探针标好及模板去除后，加入2ul0.2M的EDTA ( pH8.0 )终止反应；加入2.5ul4M LiCI，lul l0mg/ml tRNA和75ul无水乙醇，混合后，-20℃沉淀过夜；4℃，13000rpm离心10min，去上清；沉淀用70%乙醇洗2次；超净台吹干，溶于100ulDEPC处理的ddH2O中，55℃温育l0min，分装、存于-70℃备用。
2. 原位杂交探针半定量
反应试剂采用DIG Northern Blot Kit ( Roche )，反应程序参照试剂盒说明书。取试剂盒提供的Dig labeling RNA标准品做梯度稀释，浓度依次为：10pg/ul，30pg/ul，100pg/ul，lng/ul，l0ng/ul。取标记好的OsAGAP( )和OsAGAP(一)探针分别以如下比例稀释：1/4，1/16，1/64，1/256，1/1024。将以上梯度稀释的Dig labeling RNA标准品、OsAGAP( )、OsAGAP(一)溶液，各取1ul点在2x3厘米的带正电荷的尼龙膜(Bio-Rad)上，超净台吹干，120℃，烘烤30分钟以将RNA固定在尼龙膜上。
将膜在Malefic acid buffer中室温平衡2min；倒出液体，加入1 X blockingsolution室温轻摇30min；换上Antibody ( Roche ) solution ( Anti-DIG-Ap：1Xblocking solution=1:10000)，在室温中放置30-120min；倒出液体，用Washingbuffe：漂洗2 X 15min；倒出液体，加入TNM50室温平衡3min；倒出液体，加入显色液BCIP/NBT:稀释液=1:50(华美公司)，暗中显色，显色结束，用蒸馏水漂洗尼龙膜终止反应。根据Dig labeling RNA标品的显色强度为标准，分别计算正、反义探针浓度，备用。
3. 植物材料的固定与石蜡包埋
植物取材时，用到的镊子、剪刀都是先用酒精灯灼烧，尽量保证不受RNase污染。用RNase free的FAA固定液中固定，真空抽气至材料沉底，室温放置过夜；经50%，70%，90%，100%，100%，100%，100%乙醇处理逐级脱水，每步30min；25%二甲苯-75%乙醇、50%二甲苯-50%乙醇、75%二甲苯-25%乙醇、90%二甲苯-10%氯仿、90%二甲苯-10%氯仿、90%二甲苯-10%氯仿透明材料，每步30min；50%二甲苯-50%石蜡(Sigma)中，42℃，4-16hr；重复一次；将材料移入60℃温箱，更换为纯石蜡浸蜡；60℃保温，每12小时更换石蜡一次，期间更换4次纯石蜡；包埋蜡块，4℃保存。
4. 切片与粘片
将材料切成6um厚的蜡带(幼穗除外，16um)，显微镜下镜检，挑选合适部位的蜡带，小心地将蜡带放在置于42℃展片台上的涂有多聚赖氨酸化载玻片(Sigma)的水面上，至蜡带平整熨贴；吸掉载玻片上的水，42℃温箱中粘片48hr以上备用。
5. 杂交和显色
贴好材料的片子经过100%二甲苯2 X 20min、以及2/3二甲苯-1/3乙醇、1/3二甲苯-2/3乙醇、100%，100%，90%，70%，50%，30%，10%乙醇、ddH2O，ddH2O脱蜡、复水，每步2min；然后，转入37℃预热的、含1-5ug/ml蛋白酶K (Roche)的蛋白酶K buffer中，37℃处理30min；用灭活的DEPC-ddH2O洗涤3次；将片子放入刚刚混合好的乙酰化溶液中，5min；再用2 X SSC处理两次，每次5min，；经10%，30%，50%，70%，90%，100%，100%乙醇梯度处理，每步2min；片子42℃晾干，每张载玻片上加75ul杂交液，用parafilm膜轻轻覆盖，在湿室中，42℃杂交过夜；
4X SSC漂洗4次，每次5-l0min；转入37℃预热的，含25ug/ml RNase A(Sigma)的RNase buffer中，37℃处理30min；再经RNase buffer 37℃漂洗3次，每次15min； 800m12 X SSC漂洗2次，每次30min；800ml 0.1 X SSC漂洗30min；转入1 X PBT，平衡5min；l/20 X Blocking solution(用1 X PBT稀释)封闭30-60min；1 X PBT，平衡1 min；加入Antibody ( Roche ) solution，在湿室中放置30-120min；250ml 1 X PBT，漂洗2次，每次20min；换成TNM50室温平衡5min；在载玻片上加显色液(BCIP:NBT:稀释液==1:1:50)，暗中显色；显色合适后，置于TEbuffer中终止显色反应。
如前所述梯度脱水；然后依次1/3二甲苯-2/3乙醇、2/3二甲苯-1/3乙醇，100%二甲苯、100%二甲苯每步1-2min透明；封片。
注意事项
杂交前和杂交过程中所有物品设备应防止RNsae污染。
