凝胶层析
凝胶层析
凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。
（一）原理
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
（二）葡聚糖凝胶的种类与性能
葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。
表1－8 Sephadex1的种类与特性
型号 | 分离范围 （分子量） | 吸水量 （ml/g） | 最小溶胀时（h） 20℃～25℃ 100℃ | 床体积（ml）/干凝胶（mg） |
G10 | ＜700 | 1.0±0.1 | 3 1 | 2~3 |
G15 | ＜1 500 | 1.5±0.2 | 3 1 | 2.5~3.5 |
G25 | ＜5 000 | 2.5±0.2 | 3 1 | 4~6 |
G50 | 1500～20 000 | 8.0±0.3 | 3 1 | 9~11 |
G75 | 3 000～70 000 | 7.5±0.5 | 24 1 | 12~15 |
G100 | 4 000～15 000 | 10.0±1.0 | 72 1 | 15~20 |
G150 | 5 000～800 000 | 15.0±1.5 | 72 1 | 20~30 |
G200 | 5 000～30 0000 | 20.0±2.0 | 72 1 | 30~40 |
G25、G50有四种颗粒型号：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、细（20µ~80µ）和超细（10µ~40µ）。G75～G200又有两种颗粒型号：中（40µ～120µ），超细（10µ～40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。
表1－9 DEAE－纤维素与Sephadex1比较
项 目 | DEAE纤维素 | Sephadex |
交换量 | 小 | 较大 |
非特异性吸附 | 较大 | 小 |
分离纯度 | 较好 | 好 |
分离时间 | 较粗 | 较长 |
应用范围 | 较窄 | 较宽 |
预处理 | 繁琐 | 方便 |
（三）试验方法
1．凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。
2．凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定（见表1－10）。
表1－10 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量
层析柱规格 | 凝胶的规格和用量（g） | |||||
直径（cm） |
高（cm） |
容量（ml） |
G25 |
G50 |
G100 |
G200 |
0.9 | 15 | 9.5 | 2.5 | 1 | 0.6 | 0.3 |
0.9 | 30 | 19 | 5 | 2 | 1.2 | 0.6 |
0.9 | 60 | 38 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 20 | 40 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 40 | 80 | 20 | 8 | 5.0 | 2.4 |
1.6 | 70 | 140 |
推荐
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