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大鼠星型胶质细胞培养实验——胰酶消化法

2019.4.03
实验材料

SD大鼠

试剂、试剂盒

苯巴比妥解剖液胰蛋白酶DnaseDM培养液

仪器、耗材

离心管培养箱手术器材

实验步骤

一、 取14.5d SD大鼠一只。

二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射,待麻醉后置于手术台上,酒精棉球消毒皮肤,开腹取出子宫(约12-14个),放入解剖液中,剖开子宫,取出胚胎,放入解剖液中,在耳眼之间离断,取头侧部组织,去除脑膜组织,取原始中脑区组织,放入离心管装的解剖液中,待全部取出后,1500转2分钟。

三、 用吸管吸出上清液,在组织细胞沉淀中加入胰蛋白酶一管(1 ml/vial),室温30分钟,1500转,离心5分钟(离心前可加入解剖液以终止胰酶作用)。

四、吸去上清,在组织细胞沉淀中加入Dnase 一管(2 ml/vial),37℃反应10分钟,1500转,离心5分钟,吸去上清,在组织细胞沉淀中加入2 ml DM培养液吹打,计数(计数公式为(N1+N2+N3+N4)/4x104),以3x105个/瓶在培养瓶中培养,做好标记(时间、原代还是第几代传代,姓名,细胞名称等),放入培养箱中培养。

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注意事项

1.  麻醉药剂量应梢大于普通用量。

2.   一定要仔细剔除干净脑膜组织,否则会极大地影响培养细胞的纯度。

3.  细胞培养技术不同于分子生物学,由于离心速度较慢,离心组织和细胞贴壁不如核酸紧密,取出离心后的上清液时一定要用吸管吸取,禁止用倾倒的方法。

4.  为保护胚胎,胚胎操作应在放置冰块的托盘中进行,保持低温。

5.  取中脑组织时应先用两把镊子夹住所取区域,然后用刀片切开。

6.  胰酶在细胞离心时会对细胞产生毒性,所以胰酶离心前可加入一定的解剖液稀释。

7.  细胞离心时最好在冰冻离心机内进行,以保持细胞活力。

8.  吹打细胞前用火烧吸管头,发红时逐渐后退,使吸管尖变钝,减少吹打过程中对细胞的损害,实验中也发现吹打时有一定的阻力。

9.  鼠胚胎较多时可分批消化,否则体外时间较长,细胞存活率低。

10.  用Neurobasal medium + B27。

11.   胰酶消化时加入EDTA可增强消化效果。

12.  关键在于取材的准确和原代细胞的状态。

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