RNA甲基化测序
1、NSUN2影响m5C在HEK293细胞中整体分布情况
NSUN2被报道是RNA甲基转移酶，能使tRNAs和mRNA发生m5C甲基化修饰。为了探究NSUN2对HEK293细胞mRNA m5C甲基化修饰的影响。作者利用CRISP/Cas9技术敲减NSUN2（NSUN2-/-HEK293细胞）后进行RNA-BisSeq。经过生信分析，发现在HEK293细胞有12442个m5C位点，在NSUN2-/-HEK293细胞中有3270个m5C位点，在注释mRNA中分别有1142个和376个m5C甲基化位点（A）。且NSUN2下调能够降低m5C甲基化程度（B）和部分染色体上m5C位点数目（C）。但是，NSUN2下调并不改变m5C位点的motif偏好性，HEK293细胞中，CG含有22%，CHG含有33%，CHH含有45%；NSUN2-/-HEK293细胞中，CG含有24%，CHG含有33%，CHH含有43%（C、D）。这些数据显示，NSUN2能够影响m5C位点在HEK293细胞中的分布。
2、NSUN2调节的差异m5C mRNA的功能预测
为了进一步探究NSUN2如何影响HEK293细胞功能。作者对发生差异m5C mRNA（DMGs ）进行了GO和KEGG注释分析。GO注释显示这些DMGs与转录起始、mRNA分解代谢过程、RNA剪接、RNA输出、mRNA稳定性调节及基因表达均有显著相关（A）。KEGG分析显示与核糖体、剪接体、RNA运输和凋亡通路以及PI3K-Akt信号通路显著相关（B）。这些结果说明，NSUN2调节的m5C甲基化可能通过RNA的合成和翻译，进一步影响基因表达水平。
3、NSUN2对mRNA的表达水平的影响
为了探究NSUN2调节的m5C RNA甲基化对mRNA表达水平的影响，作者对NSUN2-/-HEK293和HEK293细胞进行了RNA-seq。结果显示有790个差异表达的基因（DEGs），其中467 个上调，323 个下调（A）。为了进一步探究NSUN2对这些DEGs功能的影响，作者对DEGs进行了GO和KEGG注释分析。GO注释显示这些DMGs与细胞黏附、神经系统发育、细胞表面受体信号传导、细胞分化、细胞增殖均有显著相关（B）。
4、NSUN2能够调节HEK293细胞的增殖和迁移
有研究报道NSUN2能够促进一些癌症细胞的增殖和迁移。为了进一步探究，NSUN2对HEK293细胞增殖和迁移的影响，作者进行MTT、克隆形成和划痕实验。结果显示下调NSUN2能够抑制HEK293的增殖（A，B）和迁移（C）。
5、NSUN2能够恢复NSUN2-/-HEK293细胞增殖和迁移能力
为了证明NSUN2确实影响HEK293细胞的功能，作者在NSUN2-/-HEK293细胞中过表达NSUN2后（A），进行MTT和划痕实验。结果展示NSUN2能够恢复NSUN2-/-HEK293细胞增殖和迁移（B-C）。
6、与细胞增殖和迁移相关的差异基因的表达谱
以上结果都证明NSUN2与HEK293细胞的增殖和迁移相关。为了探究与其相关的基因，作者通过GO注释，发现了86个 DEGs与增殖相关（D）、57个 DEGs与迁移相关（B）、32个 DEGs与增殖和迁移相关（C）。
7、PCR验证与增殖和迁移相关的差异表达的基因
为了探究测序的可靠性，作者通过PCR探究了7个与增殖和迁移的关键基因（FN1, CD44, GRB2, TGFB1,ITGA3, THBS1的表达，跟测序结果一致（A）。同时，发现NSUN2能够恢复NSUN2-/-HEK293中CD44, GRB2的表达（B）。这说明测序数据是可靠和可信的。
总结
RNA甲基化依然是当下生命研究竞相追逐的科研热点，本文作者的研究思路跟m6A的典型研究模式异曲同工。作者从m5C 甲基化酶（NSUN2）出发，并对其进行干预后，进行m5C RNA甲基化测序和RNA-seq，然后将表观转录组学和转录组学进行联合分析，探究该酶调控的靶基因，从而探究NSUN2通过影响基因表达参与HEK293细胞功能的调控。这种方法对于探究酶调控的靶基因，简单快捷高效，且多组学联合分析，文章内容丰富，可呈现的信息多样，是目前通过酶研究甲基化的一大利器，受到众多科研工作者的追捧。
