LncRNA搭上m6A后逆袭为新星
m6A RNA甲基化是当前在LncRNA，环状RNA等非编码RNA之后最为火热的科研明星，到底有多火？摆出数据告诉你！
2019年才过去一半还不到，已发表文章数就已占去年的7成。RNA甲基化领域，不仅文章数量多，高分文章也有许多。据统计，仅2019年上半年就发表了多篇Nature，Cell，Cell Stem Cell，Nature Immunolgy这类的顶级期刊，10分以上m6A文章就有18篇之多。
m6A RNA甲基化作为2018年国自然热点，申请的课题主要围绕writer，eraser和reader。
做腻了writer，eraser？那让我们来看看reader，YTHDF家族由于在核外参与蛋白翻译和降解，是reader里最明星的研究对象，可m6A reader酶千千万万，您研究的基因除了YTHDF家族外，可能还与其他reader结合。
今天，让我们开开脑洞，谈一谈另一个reader hnRNPA2B1，看看像这类核内核外都有表达的reader是怎么来做研究的。
文章导读
结直肠癌Colorectal cancer（CRC）是一类肠道发生癌变的疾病。目前，关于CRC发生和转移相关的分子机制还未有详细报道。已有研究指出，LncRNA分子在肿瘤发生，发展，甚至是迁移的过程中发挥重要机制。因此，本文以LncRNA为切入点，首先通过LncRNA测序找到一个目标LncRNA---RP11，在CRC中高表达的趋势，且表型与细胞迁移正相关。接着，通过RNA Pull Down-质谱技术，证实该LncRNA与下游蛋白hnRNPA2B1是直接结合关系，该蛋白可是m6A RNA修饰的明星阅读酶（Reader）呀！那这个LncRNA势必也参与了m6A RNA 甲基化的过程。接下来，让我们跟随作者思路，看看LncRNA结合m6A的机制类文章是怎么做的。
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：7.8
实验方法：LncRNA 测序，MeRIP-qPCR，RNA Pull Down，RIP，LncRNA定量PCR，mRNA定量PCR
实验材料：CRC临床样本等，结直肠癌细胞系等
文章内容
LncRNA RP11在CRC细胞和组织中高表达
CRC组织（癌症1期和癌症3期）与癌旁组织分别进行LncRNA测序（云序可提供此服务），筛选到在癌症1期和3期都差异高表达的LncRNA---RP11。在测序样本和32个临床样本组织中，通过LncRNA 定量PCR证实其在实验组中高表达。已有结肠癌和直肠癌数据库结果也证实这类表达趋势。RP11在多个结直肠癌细胞系中广泛表达，并在CRC患者转移性淋巴结组织原代培养的SW620细胞中高表达。
图1. RP11在CRC组织和细胞中高表达
2.RP11在体内和体外诱导CRC细胞散布
为进一步阐明RP11在体内和体外的功能机制。作者首先证实RP11过表达细胞系能够显著促进细胞的迁移能力。由于此过程影响了E-Cad，FN和Vim等标志物蛋白的表达量，因此可能与EMT和癌症转移相关。接着，作者在异种移植肿瘤的裸鼠体内高表达RP11基因，发现该基因能够促进肿瘤的增殖。作者在裸鼠体内通过尾部注射方式，导入稳定高表达RP11的癌症细胞，饲养8周后，发现这些细胞转移至小鼠肝脏组织中。
图2. 体外：RP11促进癌细胞迁移
体内：RP11促进癌组织增殖和迁移
3.转录因子Zeb1介导RP11调控CRC细胞散布
已有研究表明，LncRNA能够通过顺势调控机制影响其周围的转录本表达。因此，本研究在LncRNA RP11周围找到了6个转录本，分别为NUDT12, C5orf30, PPIP5K2, GIN1, RP11-6 N13.1和CTD-2374C24。通过mRNA定量PCR证实以上转录本不管是在RP11高表达组以及RP11表达量最高的SW620细胞系中，都未差异表达。所以，RP11的功能机制不是通过顺势调控的模式影响的。
既然不是顺势调控引起的，那还会是什么呢？
是否是下游结合蛋白呢？
为了证实以上猜想，作者在过表达细胞中通过mRNA定量PCR技术，检测了多个与EMT相关因子的表达量，检测结果显示Zeb1与RP11的表达模式正相关。并且在Zeb1过表达细胞系中，证实能够影响FN和Vim标志物的表达量。因此，RP11的下游可能是Zeb1。
为了验证前面的猜想，作者通过Zeb1 RIP-LncRNA PCR（云序可提供此服务）和RP11 Pull Down-质谱技术（云序可提供此服务），证实Zeb1与RP11在mRNA和蛋白层面都不是直接结合的关系。
图3. Zeb1可能是RP11间接的下游
4.RP11-hnRNPA2B1-mRNA复合体参与RP11调控Siah1和Fbxo45
同样的，作者推测下游蛋白可能是Siah1和Fbxo45。在mRNA层面，通过RP11 RIP-mRNA PCR，证实两者调控了RP11和Zeb1的表达。在蛋白层面，通过RP11 Pull Down-质谱技术证实三者并非直接结合。
那到底是什么蛋白连接着三者呢？
为证实RP11是如何调控下游mRNA Siah1和Fbxo45，作者在前期RP11 Pull down-质谱结果中，找到与RP11直接结合的hnRNPA2B1蛋白。hnRNPA2B1 RIP-mRNA PCR实验证实RP11，Siah1和Fbxo45在mRNA层面是直接结合的关系。已有研究表明hnRNP2B1是一种RNA结合蛋白，在细胞核及细胞质中广泛分布。通过结构分析LncRNA结构，证实其能够与Siah1的CDS区和Fbxo45的3’UTR区结合。总的来说，RP11通过形成RP11-hnRNPA2B1-mRNA复合体调控下游mRNA Siah1和Fbxo45的表达。
图4. RP11形成RP11-hnRNPA2B1-Siah1-Fbxo45复合体参与细胞迁移
5. m6A修饰参与CRC细胞中RP11表达上调机制
首先，作者怀疑RP11的高表达与DNA甲基化相关，通过DNA甲基化抑制酶处理细胞后，发现RP11表达量不变，证实在CRC细胞中RP11表达量与DNA甲基化无关。同时，实验也证实其与组蛋白乙酰化无关。
那到底是什么修饰调控了RP11的表达呢？
已有研究表明m6A修饰调控LncRNA的表达及功能过程。作者通过MeRIP-qPCR技术（云序可提供此服务），在三种细胞系中都证实了RP11上发生了m6A RNA甲基化修饰。并且分别过表达甲基化转移酶METTL3和去甲基化转移酶ALKBH5都能够影响RP11的表达。接下来，作者旨在CRC细胞中深入研究m6A 修饰是如何调控RP11表达的？首先，笔者借助Act-D物质抑制转录过程，发现在Mettl3过表达组中RP11的表达量没有受到影响，原因可能是Mettl3促进RP11在染色质中积累，从而对RP11的表达起到了稳定作用。m6A reader蛋白hnRNPA2B1参与了此过程。
图5. RP11存在m6A修饰并受Mettl3和AlKBH5调控
6. m6A/RP11/Zeb1间的关系和CRC细胞体内的进展
通对分析大量不同分期临床样本表达情况表明m6A修饰先调控RP11，RP11在影响Siah1-Fbxo45/Zeb1。借助KM曲线，作者发现高表达RP11直肠癌患者的生存情况并不乐观。同时，也分析了下游基因与病人其他临床指标间的关系。总体而言，证实了m6A/RP11/Zeb1促进了CRC的发生发展过程。
总结
在本研究中，作者首先通过LncRNA高通量测序手段，在CRC疾病组中筛到高表达的LncRNA----RP11，并证实其能够促进肿瘤迁移。
随后，作者旨在研究RP11下游结合蛋白是什么，是如何调控促进迁移表型的。
一方面：借助LncRNA Pull Down，快速锁定与RP11结合的蛋白就是m6A reader hnRNPA2B。通过RIP-PCR，快速找到与该蛋白结合的RNA是RP11。另一方面，借助MeRIP-qPCR，证实在3种疾病相关细胞系中RP11上都存在着m6A 修饰的情况。同时，Mettl3作为其上游促进RP11稳定性，从而促进CRC的发生发展。
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