紫外吸收法测定蛋白质含量
(一)原 理
蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基,它们的结构中具有共轭双键,对紫外光有吸收作用,其最大值在280nm波长处。在此波长附近,蛋白质溶液的光吸收值与其含量(范围是0.1~1.0mg/ml)成正比,因此,280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定,并作标准曲线,即可求得未知溶液的蛋白质浓度。此法测定迅速,用量较少,而且不消耗样品和试剂。但若样品中含有其他在280nm吸收的物质,如嘌呤嘧啶等化合物时,就有干扰作用。
(二)试剂及器材
(1)标准蛋白质溶液:准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清白蛋白,配制成浓度为1mg/ml的溶液。
(2)待测蛋白质溶液:浓度为1mg/ml左右的蛋白质溶液。
(三)操作
1. 280nm的光吸收法
(1)标准曲线的绘制:取8支试管,编号后按下表加入试剂。
管号 试剂(ml) |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
标准蛋白质溶液 | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3.0 | 4.0 |
蒸馏水 | 4 | 3.5 | 3.0 | 2.5 | 2.0 | 1.5 | 1.0 | 0 |
蛋白质浓度(mg/ml) | 0 | 0.125 | 0.25 | 0.375 | 0.50 | 0.625 | 0.75 | 1.0 |
OD280 |
混匀 ,选用光程为1cm的石英比色杯,在紫外分光光度计280nm波长处以0号管调“零”分别测定各管溶液的光密度(OD280)。以纵坐标为光密度值,横坐标为蛋白质浓度绘出标准曲线。
(2)样品测定:取待测蛋白质溶液1ml,加入蒸馏水3ml,混匀,按上述方法测定280nm波长处的光密度值,并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
2.280nm和260nm的吸收差法
将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2~2.0之间,在波长280nm和260nm处以相应的溶液作空白对照,分别测得待测样品的光密度值(OD280和OD260)。应用280nm和260nm的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。
公式: 蛋白质浓度(mg/ml)=1.45 OD280—0.74 OD260