过氧化氢酶的测定实验
| 实验方法原理 | H2Ｏ2：H2Ｏ2 氧化还原酶。 H2Ｏ2 →Ｏ2 + H2Ｏ 这个绿色的酶有四个相同的亚基组成（Mr＝60 000）， 每一个亚基携带一个正铁血红素 IX 基团，这个基团处于高速旋转状态，核心是一个三价的铁。铁离子的四个配位位点被卟啉结构占据，第五个位点被蛋白质的组氨酸得到。第六个位点保持自由状态，但也有可能被氰化物或者氟化物这样的阴离子占据，并阻碍酶反应。氰化物结合后会减少铁移入卟啉环平面，高速旋转状态变为低速旋转状态，同时伴随着一种很大的光谱移动（回顾请查阅 Nicholls 和 Schonbaum，1963）。过氧化氢酶是被 Sumner（1937） 最早结晶的酶之一，并且由于它髙度的结晶倾向性，晶体悬浮液是首选的储存形式。酶底物的过氧化氢会在高浓度的时候破坏酶。因此，酶实验不能发生在底物饱和的环境下，而且 Km 也不能直接被动力学分析确定。在 405 nm 处酶的吸收系数为 38×103 l/（mmol·mm）[9.5 l/（mmol·mm）每血红素基团]。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 实验所需「试剂」具体见「其他」 0.98 ml H2Ｏ2 溶液 0.02 ml 酶样品（浓缩的原料用 0.05 mol/L 磷酸钾溶液 pH 7.0 稀释大约 2000 倍） 25℃ 在比色皿中测量的吸收值于 240 nm 处降低；ε240＝4.0 l/（mmol·mm）。每分钟吸收值变化 0.04 相当于每分钟分解 1 umol H2Ｏ2，约 1 IU，约 16.67 nkat。 展开 |
| 注意事项 | |
| 其他 | 试剂： 0.05 mol/L 磷酸钾，pH 7.0 H2Ｏ2 溶液（约 10 mmol/L）：0.06 ml 30％ H2Ｏ2 稀释于 50 ml 0.05 mol/L 磷酸钾 pH 7.0 中，在 240 nm 处以缓冲液为对照的吸收值应该是 0.50±0.01.否则要用缓冲液或者 H2Ｏ2 调节这个值。 展开 |
