抗原特异性T细胞克隆的制备——间歇循环刺激法
实验概要
本实验利用间歇循环刺激法制备了抗原特异性T细胞克隆。
实验原理
间歇循环刺激法是制备抗原特异性T细胞克隆的传统方法，原理是经抗原间隔刺激多个循环。
主要试剂
1. 含10％人AB型血清的完全RPMI 1640培养液。
主要设备
1. 24孔培养板；
2. CO2 温箱；
3. 高速离心机；
4. 96孔板；
5. 超净工作台；
6. 显微镜。
实验材料
1. 抗原致敏供者的单个核细胞(MNC)和经过3300rad照射的自身MNC；
2. 抗原。
实验步骤
1. 抗原刺激：于24孔培养板加入单个核细胞5×106 /2ml/孔和最适浓度的抗原，置37℃，5％CO2 温箱培养7d。
2. 间歇循环刺激：
1) 重悬经过抗原刺激的细胞，并经密度梯度离心，收集界面层细胞，用无血清的RPMI-1640洗二次；
2) 调整细胞浓度至1×106 /ml，加入24孔培养板孔中，同时各孔加入经过照射的自身MNC 4×106 ，以未照射的自身细胞作为饲养细胞和抗原提呈细胞，培养7d；
3) 同步骤1)收集和洗涤细胞；
4) 调整细胞浓度至1×106 /ml，与2～3×106 新鲜照射的自身MNC及抗原共同培养7d；
5) 重复步骤2)～4)共3个循环；
6) 收集细胞，通过增殖试验测定抗原的特异性。
3. T细胞克隆：间歇循环刺激培养的细胞经有限稀释，于96孔板依次加入不同浓度的细胞悬液，同时克隆板孔中加入104 经过照射的自身MNC、IL-2 30U和适当浓度的抗原，同上述条件培养7～10d，显微镜下观察细胞生长情况。将生长良好的抗原特异性细胞转至24孔板孔中，加入自身饲养细胞和抗原，继续培养7d，传代并经间歇刺激培养。
注意事项
1. 上述方法制备的T细胞克隆未区分出CD4 和CD8 T细胞，二者均可能被克隆；
2. 在有限稀释之前，IL-2的量不宜过高，否则可能发生T细胞非特异性增殖。
