马、驴源性成分核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法...
说明
物种鉴定系列可针对食品、饲料等样品中动物源性成分的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于马、驴源性成分的检测，检出限为0.1%。
◆ 产品组成（96测试）
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021072LⅡ |
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试剂 |
含量 |
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A-马、驴源-P |
20μL × 8管× 12排 |
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NG-P |
100μL × 3支 |
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PG-马、驴源-P |
100μL × 2支 |
适用仪器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。
◆ 自备耗材和仪器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：样本制备区。
2）第二区：模板添加区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆样品处理
参照《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法》或其他标准处理样品，制备的样本保存待用。
样品的采集和制备是动物源性鉴别的重要步骤，为防止交叉污染，应使用一次性消耗品，研钵应经160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高压处理的器皿应使用1%次氯酸钠溶液浸泡。
取样应尽量采取肌肉组织，对于同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取DNA。
采样过程应快速完成，将采取的样品迅速放入组织搅碎机中进行均质成糜状，充分混匀，取0.1 g充分混匀的样品，采用液氮研磨或均质器均质。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
1.模板制备（样本制备区）
建议使用配套动物基因组DNA提取试剂盒，具体过程详见产品说明书。
2.添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）
剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-马、驴源-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
3.扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。
按下列条件设置扩增反应：
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PCR循环 |
荧光收集位点 |
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95℃ |
10分钟 |
1个循环 |
— |
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95℃ |
15秒 |
40个循环 |
— |
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60℃ |
1分钟 |
※ |
4.基线和阈值设定
基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点
◆结果判定
检测样品无Ct值，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有马、驴源性成分或含量低于检出限；
检测样品Ct≤35，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有马、驴源性成分；
检测样品Ct＞35，可直接报告样品阴性，不含有马、驴源性成分或含量低于检测限。
NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。
