诺如病毒GI型、GII型RNA核酸检测试剂盒(IAC，一管式PCR-荧...
诺如病毒GI型、GII型RNA核酸检测试剂盒(IAC，一管式PCR-荧光探针法)使用说明
诺如病毒GI型、GII型RNA核酸检测试剂盒（IAC，一管式PCR-荧光探针法）
◆ 产品说明
诺如病毒GI型、GII型RNA核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）参照GB 4789.42-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验》进行设计，可于一个反应中同时检测GI型、GII型诺如病毒；适用于贝类生，食蔬菜，胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品，草莓、西红柿、葡萄等软质水果等食品中GI型、GII型诺如病毒核酸的检测。
◆ 产品组成（48测试）
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012172MII |
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试剂 |
含量 |
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A-GIGII |
20μL× 7管×4排 |
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IAC-Nor |
20μL× 5管×4排 |
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B-Nor |
500μL × 1支 |
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PG-Nor |
100μL × 1支 |
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NG-Nor |
100μL × 1支 |
◆ 适用仪器
ABI 系列、MJ 系列、Roche 系列、博日系列以及其它荧光定量PCR 检测仪（可同时检测FAM通道（494 nm）、VIC通道（538nm）两种通道的荧光定量PCR仪）。
◆ 自备耗材和仪器
①冰盒；②移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头（RNase free）；③离心机；④涡旋混匀器。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：试剂准备区。
2）第二区：样本制备区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，使用移液器，试验产生的所有废弃物及时处理。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前剪下所需的测试数，解冻后使用前离心30秒。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 试剂盒组分及样品处理说明
（1）样品前处理请参照GB 4789.42-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验》进行样品前处理。
（2）A-GIGII为GI、GII反应液，含有诺如病毒GIGII型引物探针。
（3）IAC-Nor为过程控制反应液，含有过程控制病毒引物探针。
（4）B-Nor为提取过程控制液，进行样品RNA提取时请参照国标法加入10 μL B-Nor作为提取过程控制；亦可参照国标法另取50-100 μL B-Nor，用PBS缓冲液补足至200 μL，进行核酸提取、标准曲线制作及计算提取效率。
（5）NG-Nor为阴性对照，也可参照国标法提取阴性样品核酸作为阴性对照进行实验。
（6）PG-Nor含GI型、GII型诺如病毒核酸，可作为阳性对照，亦可参照国标法作为扩增控制计算抑制指数。
*推荐使用我们公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒中的方案进行病毒RNA的提取，或者采用其他等效产品进行RNA提取。
◆ 实验操作（推荐）
1. 反应体系配制：（样本制备区）
剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，并参照下表进行编号，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，使用穿刺加样法穿过固封层向每管反应液中分别加入模板。
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孔编号 |
实验意义 |
反应液 |
加入模板 |
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A |
空白对照 |
A-GIGII |
5μL RNase free water |
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B |
阴性对照 |
A-GIGII |
5μL阴性对照 |
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C |
病毒提取过程控制1 |
IAC-Nor |
5μL样品RNA |
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D |
病毒提取过程控制2 |
IAC-Nor |
5μL过程控制病毒RNA |
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E |
病毒提取过程控制3 |
IAC-Nor |
5μL 101倍稀释过程控制病毒RNA |
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F |
病毒提取过程控制4 |
IAC-Nor |
5μL 102倍稀释过程控制病毒RNA |
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G |
病毒提取过程控制5 |
IAC-Nor |
5μL 103倍稀释过程控制病毒RNA |
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H |
扩增控制1 |
A-GIGII |
5μL样品RNA+1μL扩增控制RNA |
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I |
扩增控制2 |
A-GIGII |
5μL 10倍稀释样品RNA+1μL扩增控制RNA |
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J |
扩增控制3 |
A-GIGII |
5μL RNase free water+1μL扩增控制RNA |
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K |
样品1 |
A-GIGII |
5μL样品RNA |
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L |
样品2 |
A-GIGII |
5μL 10倍稀释样品RNA |
配制完成后请盖上PCR管盖，涡旋混匀并离心后上机反应。
*请参照上表对管进行编号，以免混淆。
2. 扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量PCR仪进行检测，编号A～B，H～L使用FAM和VIC通道，编号C～G使用FAM通道。
按下列条件设置扩增反应：
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PCR循环 |
荧光收集位点 |
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50℃ |
10分钟 |
1个循环 |
— |
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95℃ |
5分钟 |
1个循环 |
— |
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95℃ |
10秒 |
45个循环 |
— |
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60℃ |
30秒 |
※ |
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
◆ 结果判定
1. 实验有效性判定：
（1）实验满足：空白对照阴性（A反应孔)；阴性对照阴性（B反应孔）；阳性对照（J反应孔）阳性；否则本次实验无效，请与本公司技术支持联系。
（2）过程控制（C~G反应孔）需满足：提取效率≥1%；如提取效率＜1%，需重新检测；但如提取效率＜1%，检测结果为阳性，也可酌情判定为阳性。
（3）扩增控制（H~J反应孔）需满足：抑制指数＜2.00；如抑制指数≥2.00，需比较10倍稀释食品样品的抑制指数；如 10 倍稀释食品样品扩增的抑制指数＜2.00，则扩增有效，且需采用10倍稀释食品样品RNA的Ct 值作为结果；10倍稀释食品样品扩增的抑制指数也≥2.00时，扩增可能无效，需要重新检测；但如抑制指数≥2.00，检测结果为阳性，也可酌情判定为阳性。
2. 结果判定
待测样品的Ct值大于等于45时，判定为诺如病毒阴性；待测样品的Ct值小于等于38时，判定为诺如病毒阳性；待测样品的Ct值大于38，小于45时，应重新检测；重新检测结果大于等于45时，判定为诺如病毒阴性；小于等于38时，判定为诺如病毒阳性。
