沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）使用说明
沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）参照《SN/T 1870—2016 进出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法》进行设计，可针对增食品、饲料等样品中沙门氏菌的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。该产品检出限为103 cfu/ml（使用旋达071021M细菌基因组DNA提取试剂盒提取1 ml 103cfu/ml增菌液的细菌基因组DNA作为模板）。
◆ 产品组成（ 12测试）
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011012S |
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试剂 |
含量 |
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A-Sal-P |
250μl |
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PG-Sal-P |
25μl |
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NG |
25μl |
◆ 适用仪器
ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600荧光定量PCR仪。
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②灭菌0.2mL PCR管或八联管；③冰盒；④移液器（11-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴；⑧均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑨电子天平。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：试剂准备区。
2）第二区：样本制备区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，使用移液器，试验产生的所有废弃物及时处理。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》进行沙门氏菌的样品制备、增菌培养和分离。
◆ 实验操作
将试剂完全解冻，各组分离心30s。
1. 试剂配制（试剂准备区，放置于冰盒中进行）：
若有N个待检样品，则参照下表，按照N+2个数量计算各组分用量（N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照），将反应液置于1.5ml或者2.0ml离心管中，漩涡混匀，离心30秒，分装于0.2mL PCR管中。
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试剂 |
使用量 |
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A-Sal-P |
20×(N+2)μl |
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反应液总体积 |
20×(N+2)μl |
模板制备（样本制备区）
建议使用试剂配套细菌组DNA提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
3．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
在步骤1中已含有反应液的PCR管中加入5μl模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-Sal-P。涡旋混匀30s，离心1min，立即进行扩增反应。
4. 扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。
按下列条件设置扩增反应：
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PCR循环 |
荧光收集位点 |
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95℃ |
10分钟 |
1个循环 |
— |
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95℃ |
15秒 |
40个循环 |
— |
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60℃ |
30秒 |
※ |
6.基线和阈值设定
基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点
◆ 结果判定
检测样品Ct≥40，可报告样品阴性，不含有沙门氏菌或含量低于检测限；
检测样品Ct＜40，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有沙门氏菌；
NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线且Ct值＜30，此次检测结果有效，否则无效。
