PCR常见问题及解决方案（二）
问题
可能原因 | 解决方法 | |
无产物或产量低 | 模板浓度偏低或偏高 | 电泳检测模板浓度，调整模板用量 |
模板降解 | 重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存 | |
模板中含有抑制反应的杂质 | 纯化模板 | |
引物浓度不足 | 调整引物浓度，特别是针对长片段PCR | |
引物存在二级结构 | 重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度 | |
引物降解 | 引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融 | |
Mg2+浓度偏低 | 适当提高Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度 | |
dNTP降解 | -20℃保存，小量分装，避免反复冻融 | |
酶纯度低，扩增效率差 | 选用高质量DNA聚合酶 | |
酶量不足 | 适当增加酶量 | |
用酶不当 | 针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南) | |
缓冲液失效 | 更换缓冲液或使用预混PCR反应体系 | |
模板变性不充分 | 适当延长变性时间；对高GC或复杂结构模板，提高起始变性温度至98℃ | |
退火温度偏高 | 降低退火温度，应比引物Tm低至少5℃ | |
延伸时间不足 | 增加延伸时间，特别是针对长片段PCR | |
循环数目不够 | 增加循环数 | |
PCR管污染 | 质量可靠的PCR管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭菌处理；用过的PCR管不可清洗后重复使用 | |
PCR仪故障 | 检查程序和模块温度 | |
其他 | 使用PCR增强剂 | |
非特异产物过多 | 体系污染 | 设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染 |
引物浓度过高 | 适当减少引物浓度 | |
引物序列特异性差 | 重新设计引物 | |
Mg2+浓度过高 | 降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度 | |
dNTP浓度过高 | 降低dNTP浓度 | |
酶量过多 | 减少酶量，以0.5 U间隔递减 | |
退火温度过低 | 提高退火温度 | |
延伸时间过短 | 增加延伸时间，以1 min间隔递增 | |
循环次数过多 | 减少循环次数 | |
模板结构过于复杂或目标片段过长 | 特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)；使用PCR增强剂 | |
其他 | HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR | |
引物二聚体 | 引物3’末端存在互补序列 | 重新设计引物 |
引物浓度过高 | 降低引物浓度 | |
模板浓度过低 | 提高模板浓度 | |
退火温度不合适 | 优化退火温度 | |
循环次数过多 | 减少循环次数 | |
其他 | HotStart PCR | |
拖尾严重 | 引物浓度过高 | 调整引物浓度 |
引物序列特异性差或模板上存在同源序列 | 重新设计引物 | |
模板降解 | 重新制备模板 | |
模板浓度过高 | 降低模板浓度 | |
dNTP浓度过高 | 减少dNTP用量 | |
Mg2+浓度过高 | 降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度 | |
酶量过多或质量差 | 减少酶量，以0.5 U间隔递减；更换质量可靠的酶 | |
变性温度过低 | 提高变性温度，以0.5℃递增 | |
退火温度过低 | 提高退火温度 | |
延伸时间过长 | 缩短延伸时间 | |
循环次数过多 | 减少循环次数，以2个循环间隔递减 | |
体系污染 | 设计对照实验，消除污染源 | |
其他 | HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR | |
假阳性 | 目标片段与非特异扩增片段间存在同源性 | 设计阴性对照，确认为引物问题后重新设计引物 |
体系污染 | 设计阴性对照判断是否有污染，去除污染源 |
