WAVETM 生物反应器中的 Cytodex™ 微载体细胞培养工艺（一）
摘要
WAVE Bioreactor 系统多用于悬浮细胞的培养。然而，用于细胞治疗和疫苗生产的多种细胞为贴壁依赖型的，需要一个可贴附的生长表面。在本研究中，Cytodex 微载体被应用在 CellbagTM 生物反应器中以扩增 Madine-Darby Canine Kidney (MDCK)和 Vero细胞。为了优化细胞贴附，测试了两种细胞株的不同摇动混合条件。我们发现培养基成分对细胞贴附有显著的影响；例如在低血清培养基中的 MDCK 和 Vero细胞，用间歇式和连续摇动混合都可以使细胞贴附到微载体上。然而，在无血清条件下，Vero细胞在间歇式摇动混合下可以获得高贴壁率。生长在 WAVE Bioreactor系统中的MDCK细胞可以被放大到2 L和10 L工作体积。 细胞达到最大密度为3×106细胞/ml。Vero 细胞在 2 L 工作体积下的Cytodex 1和Cytodex 3微载体上培养，无血清条件下达到 1.4×106细胞/ml 最大密度。用转瓶同样条件可以获得相同密度的Vero细胞，WAVE中细胞生长速度更快。
数据显示 WAVE Bioreactor 系统是成功用于 MDCK 和 Vero 细胞微载体培养的通用平台，可以方便的进行规模放大，是对传统搅拌罐生物反应器或转瓶的一种快速和方便的替代系统。
介绍
与滚瓶 (Roller Bottle)中的细胞培养不同，贴壁细胞在微载体上的培养使它相对容易进行生产工艺的规模放大。此外，微载体使细胞能够在生物反应器中扩增，与多个小T型瓶等塑料培养容器相比，生物反应器可以提供更好的工艺参数自动控制，降低劳动强度的同时减少污染的危险。一次性生物反应器的使用减少了投资成本、提高灵活性（简化批次间的轮换准备等操作） ，消除了生产容器清洗验证的需要。
WAVE Bioreactor 系统是设计用于人、动物、植物和昆虫细胞培养的一次性发酵设备， 并可以用于细菌和真菌的培养。 WAVE Bioreactor系统不需要清洗或灭菌， 这减少了生物制药生产中工艺验证的需要。尽管WAVE Bioreactor 系统多用于悬浮细胞的培养，本文的研究表明WAVE反应器也适合微载体上贴壁细胞的培养。
本文描述了 MDCK 和 Vero 细胞在 WAVE Bioreactor 系统中 Cytodex 微载体上的培养。我们对微载体培养所必需的参数如最佳摇动混合条件和工作体积范围、细胞贴附效率、最大细胞密度以及从 2 L工作体积放大到10 L的可行性进行了深入研究。使用细胞特异性的参数如贴附、生长速率和最大细胞密度等，对 WAVE Bioreactor系统和转瓶培养进行了比较和评价。WAVE Bioreactor 系统中贴壁细胞培养的一般操作程序如图1所示。
图 1. WAVE Bioreactor 系统中微载体培养工艺流程图
材料和方法
细胞株，培养基和储存液 MDCK细胞来自ECACC (Nr. 84121903)。细胞培养在含有 2% FBS (CH30160.03, HyClone)的 UltraMDCK (12-749Q, Lonza)培养基中。细胞在T型瓶和细胞工厂中的常规培养和微载体培养中的接种过程中，MDCK 细 胞 先 用 PBS-EDTA (E8008, Sigma Aldrich)洗涤，然后用 accutase 酶(L11007, PAA Laboratories)进行消化。
Vero细胞来自ATCC (Nr. CCL 81)。使用DMEM/Ham’s 为基础的无血清培养基进行培养。使用含0.2% Pluronic F68 (Sigma Aldrich)的培养基在WAVE Bioreactor 系统中进行细胞括增。在T型瓶和细胞工厂的常规培养中使用胰蛋白酶（Gibco BRL）消化细胞。源于大豆(1 mg/ml in PBS)的胰蛋白酶抑制剂STI (Sigma Aldrich)和EDTA用于胰蛋白酶消化的终止。Vero细胞在接种到微载体之前用0.02% EDTA 消化。然后补加培养基。
培养容器 在常规培养中，MDCK细胞生长在T 型瓶和多层细胞工厂（Corning Life Sciences，Sigma Aldrich）中用于接种准备。
在常规培养中Vero 细胞生长在T型瓶和多层细胞工厂中，用于接种准备。在125 ml Techne转瓶(Spinner Flask, Bibby-Scientific Ltd)中进行细胞培养，工作体积为60 ml。Spinner Flask转瓶以50 rpm搅拌混合。
微载体 Cytodex 3微载体被用于MDCK细胞的贴壁培养，Cytodex 1 和 Cytodex 3 被用于Vero细胞的贴壁培养。微载体在硅化国的玻璃容器中进行水化和高压灭菌。在用不含Ca2+和Mg2+离子的PBS中洗涤3次后，微载体在121℃高压灭菌15 min，并在 4℃下无菌保存。微载体先用培养基洗涤并在接种前24 h转移到Cellbag中进行平衡。所使用的Cytodex 1和Cytodex 3 的量为3 g/l。为
