WAVETM 生物反应器中的 Cytodex™ 微载体细胞培养工艺（二）
用于MDCK和 Vero细胞的生物反应器 WAVE Bioreactor 系统由一个带有一次性塑料细胞培养袋的摇动平台组成，配备CO2 气体混合器 (CO2MIX20) 或WAVEPOD™控制塔用于控制pH、温度、氧气和混合。MDCK细胞在Cellbag-10 L和Cellbag-50 L的WAVE Bioreactor System 20/50中培养。Vero细胞在Cellbag-2 L和Cellbag-10 L的WAVE Bioreactor System 20/50中培养 。WAVEPOD 控制塔用于pH、温度、氧气和混合等参数的监测和反馈控制。
染色溶液 使用溶解于0.1 M柠檬酸中的0.1%结晶紫细胞裂解缓冲液进行 MDCK和 Vero 细胞的细胞核计数。台盼蓝（0.1%溶解在PBS中）用于测定细胞活率。 对于Vero细胞， 用于细胞固定和微载体培养物显微镜观察的 Hematoxylin 苏木紫染料溶液 (Carl Roth GmbH)由 0.9 g苏木紫、0.18 g NaIO3、15.45 g Al K(SO4)2 ×12 H20、45 g 水合Chloralhydrate (Carl Roth GmbH) 和1 g 一水柠檬酸溶解于1 L的蒸馏水中配制而成。
细胞培养-MDCK细胞 MDCK细胞按照1:5到1:6每周传代两次。对于常规细胞培养和微载体接种，MDCK细胞先用 PBS-EDTA 洗涤，然后通过与Accutase酶在37℃孵育30 min使细胞从微载体上脱落。我们取出一部分脱落的MDCK 细胞样品并用 CEDEX (Innovatis)测定细胞活率，此结果被用于计算达到目标接种密度所需的细胞数量。使用转移瓶将悬浮细胞加入到Cellbag中。
细胞培养-Vero细胞 Vero 细胞按照 1:3 到 1:4 每周传代两次。在这种条件下，经过胰蛋白酶消化的微载体接种难度较大，因为胰酶容易削弱细胞贴附从而影响细胞在微载体上的铺展。因此， 细胞用含有0.02 % EDTA的无Ca 2+ 和Mg 2+的PBS 从细胞工厂表面消化。10 层细胞工厂用 PBS 洗涤，细胞用100 ml EDTA 溶液消化后在37℃孵育 20 min。孵育后，我们加入500 ml的细胞培养基并合并所有细胞层的接种物。我们抽取一部分细胞样品用细胞血球计数器计数。使用台盼蓝染色（0.1%台盼蓝溶于PBS）测定细胞活率。下一步，我们测定达到特定接种密度所需要的悬浮细胞量，然后转移瓶中的细胞通过无菌焊接加入到Cellbag中。
取样 每天对细胞取样以确定密度和形态。在取样前，适当提高反应器的搅拌速率以保证微载体均匀悬浮 （对Cellbag-2 L为16 rpm和12°，对Cellbag-10 L为18 rpm和5°）。在提高搅拌速率2 min后，从取样口取出4 ml载体悬液，同时反应器保持连续摇动。然后反应器的搅拌参数被恢复到细胞培养时的工作参数，将样品转移到离心管中。先沉降微载体，丢弃上清，将含有 Vero细胞的微载体重悬在1 ml 含有0.1%结晶紫的0.1 M柠檬酸溶液中，然后孵育1.5 h。释放出的细胞核用血球计数器计数。对于MDCK 细胞，载体重悬在含有0.1%结晶紫的柠檬酸和Triton X-100溶液中。然后载体悬液被漩涡振荡30 s，使用 Bürker chamber计数细胞核。
0.5 ml Vero细胞微载体悬液被转移到小离心管中。在微载体沉降后，丢弃上清，贴在微载体上的Vero细胞使用0.3 ml苏木紫溶液固定并染色。微载体在显微镜下放大100倍进行观察，用于显微拍照。
微载体培养的最佳工作体积 确定Cellbag-10 L和 Cellbag-50 L的最佳工作体积。培养袋中的推荐工作培养体积为最大推荐体积的40 %（即Cellbag-10 L为2 L，Cellbag-50 L为10 L）。微载体密度为3 g/l Cytodex 3，接种密度为0.3×106细胞/ml。对每种Cellbag和培养体积，分别测试以下摇动条件：10 rpm和5º、12 rpm和5º、14 rpm和5º和12 rpm and 6º。
微载体培养的最佳混合条件 对于工作体积为2 L的 Cellbag-10 L进行最佳混合的研究。在Cellbag-10 L中培养基和微载体在 37℃和 5%二氧化碳通气下平衡 2 h。按照 0.3×106细胞/ml 的初始密度接种， 并在细胞-微载体贴附阶段使用连续的摇动方式。细胞生长 18 h 达到大约0.6×106细胞/ml 的细胞密度后，以阶梯方式逐渐提高摇动速度。在 5º、6º 和7º 下分别对初始摇速12 rpm进行测试。 摇速按照阶梯方式每小时逐渐提高，直到细胞开始从微载体上脱落。
