植物蛋白质组学和糖基化实验（四）
3.3 我的糖基化蛋白在哪
实验人员可通过这个方法获得关于糖苷在蛋白骨架上的分布及糖苷本身的结构信息。这类实验可在纯化的糖蛋白或者从 1D 或 2D 电泳胶上分离出来的蛋白上进行，首先，用蛋白内切酶消化蛋白质，通过高效液相色谱（HPLC) 分离消化后的肽和糖肽混合物。对含有糖苷的收集组分进行糖组分分析（见 25.3.2 节 2 ) ，接着分别对肽 N-糖苷酶 A 处理前后的糖肽组分进行 MALDI- TOF 质谱分析 [ 见 25.3.2 节 3)] 。
( 1 ) 将 1 mg 纯化得到的蛋白质样品溶解在 500 μl 的 50 mmol/L 碳 酸氢铵溶液（pH 8.0 ) 中，100°C 加热 3 min。
( 2 ) 加入 50 μg TPCK 处理胰酶，在 37°C 处理 2 h。
( 3 ) 再次加入 50 μg TPCK 处理胰酶，37°C 处理 2 h。
( 4 ) 如果进行双酶切处理，用 50 mmol/L 碳酸氢铵溶液（pH 8.0 ) 溶解 50 μg TPCK 处理糜蛋白酶，将其加到胰蛋白酶消化液中。37°C 处理 2h。
( 5 ) 100°C 加热 5 min 终止蛋白酶消化反应。
( 6 ) 用反向 HPLC 色谱（C18 色谱柱）分离胰蛋白酶/糜蛋白酶消化得到的肽和糖肽，使用 0~60% B 溶液的 60 min 线性梯度洗脱，流速为 1 ml/min，214 nm 紫外监测洗脱峰。A 溶液：含 0.1% TFA (三氟乙酸）的水/乙腈 （90 : 10 ) 溶液。B 溶液：含 0.1% TFA 的水/乙腈（10 : 90 )溶液。收集各组分容积为 2 ml，冷冻干燥收集到的 组分。
( 7 ) 各取 10% 的收集组分进行糖组分分析（见 25. 3.2 节 2 ) ，挑选含寡聚糖的组分。
( 8 ) 用 MALDI-TOF 质谱分析含糖肽的 HPLC 组分确定糖肽的质量。
( 9 ) 用肽 N-糖苷酶 A 消化糖肽 [ 见 25. 3. 2 节 3. 2)]。如前所述用 C18 色谱柱将肽 和寡聚糖分开 [ 见 25.3.2 节 3. 2)]。
( 10 ) 用 MALDI- TOF 质谱分析去糖基化肽，确定其质量。这些质量数据帮助实验人员鉴定被测蛋白质的糖基化位点。检测到的糖基化和去糖基化肽的质量差异将为我们提供糖蛋白上糖苷的结构信息（ 表 25-2)。
本实验方法也可以应用于未知序列的蛋白质。在这种情况下，用 LC-MS/MS ( 液相串联质谱）分析、确定糖基化肽的氨基酸序列。解离下来的糖苷也可以采用前述的特定流程的 MALDI-TOF 质谱纯化和鉴定 [18，19] 。
3.4 怎样对全糖蛋白质组进行分析
植物提取物内糖蛋白的鉴定可确定以下几点：① 哪些基因编码糖蛋白。② 潜在糖基化位点上的哪些位点确实发生了糖基化。③ 糖蛋白上的糖苷的特性与结构是什么。这些研究过程现被称为糖蛋白质组学。在动物细胞中已经实现了这些鉴定实验，但在植物糖蛋白质组鉴定方面还未见报道。
我们实验室最近开发的研究植物糖蛋白质组的策略依赖于固定化凝集素的纯化，1D 或 2D 电泳的分离，以及质谱鉴定。糖蛋白质组的分离有以下两种方法：含高甘露糖型 N-糖苷的分泌糖蛋白的纯化和 O-GlcNAc 糖基化修饰的糖蛋白的纯化。这里只着重介绍糖蛋白的选择方法，不具体介绍电泳和质谱鉴定。有关这些技术的详细信息请参见本书其他章节。
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