mRNA差异显示技术(mRNA differetial display)(2)
6.技术路线
mRNA 差异显示技术
The fluoroDD System
•Builds on the HIEROGLYPH™ system
–TMR-labeled anchored primers
–Increased primer concentrations
–Increased dNTP concentrations
–Optimized DD-PCR protocol
–TMR-labeled M.W. markers
Genomyx Research into Improving the Process of Differential Display
•Optimize gel electrophoresis
•Optimize PCR
•Optimize primers
•Streamline downstream analysis
HIEROGLYPH™ mRNA Profile Kit Primers
Advantages of HIEROGLYPH™ DD Primers
Genomyx LRS
genomyxSC and fluorescent labeling
Band Recovery with Virtual Grid and Excision Workstation
7. 差异显示的优越性
•仅需少量的总RNA（0.2-0.02ug，200个 细胞中提取的总RNA）
•PCR放大作用，灵敏度高
• 同时分析多组样品
•实验周期短，8天可以完成
•最突出的优点是实验过程中可步步验证
–RNA提取
–RT-PCR
–切胶后再扩增
–克隆
–测序
–Northern验证
–RT-PCR
8.存在的问题和对策
•假阳性率高（50-70%）
–提取RNA时，防止DNA的污染（DNA酶充分消化）
–切胶时选择差异显著的条带，选择或有或无的条带
– 基因克隆时阳性菌落的挑选
–PCR扩增中交叉污染
–Reverse Northern确认
•扩增片段短
– 扩增片段较短（〈500bp），信息少
–RACE（Rapid Amplication of cDNA Ends)
–基因文库得到 cDNA全长
9.医学中的应用
•骨科
–Boden 发现LMP-1基因，并用于基因治疗
•溃疡性结肠炎
–Zuo 发现溃结黏膜25个表达基因
•肿瘤学研究方面
是一个重要的手段。
如胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌等，并取得了令人鼓舞的研究进展。Samant等应用差异显示技术克隆和鉴定新的乳腺癌转移抑制基因（BRMS1），Chung等在小细胞肺癌中克隆出新的跨膜GTPase基因。在国内Chen等分离鉴定2个与食管癌相关的基因，SPRR3和Transglutaminase-3。
胃癌组织中，Yoshikawa等用差异显示技术分离和鉴定了2个新的基因，与正常组织比较发现它们在人胃癌中下调。Shiozaki等报道一个新的胃特异性基因CA11，它在胃癌细胞中下调，通过基因文库的鉴定
胃癌及癌前病变差异显示研究
-
焦点事件
-
焦点事件
-
项目成果
