DNA探针的非同位素标记
实验方法原理
进行Southern杂交分析时应标记不带载体的插入片段作为探针,常用的标记方法耗时很长,它包括将质粒或λDNA经限制性内切酶酶解后分离插入片段,用切口平移法或随机引物标记法进行标记。相比之下,采用PCR聚合酶链式反应法标记探针有几个优点,只需极少量的质粒DNA(50ng)作模板即可扩增出大量高效标记的插入片段。在PCR反应中加入非放射性的替换核苷酸(生物素dUTP,地高辛-11-dUTP碱不稳定型),可在数小时内合成大量标记好的探针
实验材料 LB培养基psr142引物FBA065引物dATP、dGTP、dCTP溶液Taq聚合酶
试剂、试剂盒 待标记的 DNA 探针
仪器、耗材 PCR仪电泳槽及电源微量移液器及相应吸头1.5mlEppendorf管5ml溶血管台式微量离心机37℃恒温摇床恒温水浴锅-20℃冰箱-80℃冰箱4℃冰箱
实验步骤
1.在一加有1mL LB-抗生素培养基的5mL溶血管中接种一单菌落,松松地盖上管帽,37℃剧烈振荡培养过夜。
2.取800μL菌液至一1.5mLEppendorf管中。台式离心机12000r/min离心30s。余下的菌液于4℃保存或加入40μL灭菌甘油混匀于-80℃保存。
3.弃上清液。用400μL 1%TritonX-100剧烈振荡重悬菌体沉淀。
4.菌体悬浮液煮沸5min后于冰上放置5min。细菌裂解液置于4℃或-20℃保存。
5.取一微量扩增反应管,加入以下试剂至终体积50μL:
25μL灭菌蒸馏水
10μL50%灭菌甘油
5μL 10×PCR反应缓冲液
0.5μL 5mmoL/LdATP
0.5μL 5mmoL/LdCTP
0.5μL 5mmoL/LdGTP
1μL 2mmoL/LdTTP
1μL 0.2mmoL/L地高辛-11-dUTP碱不稳定型
0.625μL 20μmoL/L引物1
0.625μL 20μmoL/L引物2
0.25μL 5U/μLTaq聚合酶
5μL细菌裂解液
6.按以下参数进行PCR扩增
1个循环:94℃,1min
35个循环:94℃,15s
48℃,30s
72℃,3min
1个循环:72℃,7min
7.取3μLPCR扩增产物进行水平琼脂糖凝胶电泳,用已知浓度的标准DNA作对照估算扩增产物的浓度。余下的PCR扩增产物置于4℃保存。
注意事项
其他
采用非同位素法检测的优点主要有:
(1)降低了实验操作者的危险,实验废物无需专门处理,从而可以处理大批RFLP分析的样品。
(2)可标记多个、大量探针以备日后之需。标记好的探针可置于-20℃保存(至少一年)。
(3)在进行RFLP分析时,化学荧光检测系统的探针、CSPDR和膜均可重复使用(分别为3～5次、3～5次、5～8次或更多)。与同位素检测方法相比更为经济。
(4)实验安排更为方便。因为无需像使用32P时那样要受同位素的衰减时间限制。
(5)室温下曝光即可,无需使用增感屏或-80℃冰箱。
(6)曝光时间短(几小时),也就是说一张膜每3d即可重新杂交一次
试剂说明：
1.LB培养基(1%胰蛋白酶,1%NaCL,0.5%酵母抽提物,pH7.0),抗生素,1%TritonX-100,灭菌超纯水,50%灭菌甘油,10×PCR反应缓冲液(0.1moL/LTris-HCL,pH8.3;15mmoL/LMgCL2;0.5moL/LKCL;1mg/mL明胶);
2.psr142引物:
20μmoL/L反向引物:5 ATTCGAGCTCGGTACC 3
20μmoL/L正向引物:5 AGGTCGACTCTAGAGG 3
3.FBA065引物:
20μmoL/L反向引物:5 AACAGCTATGACCATG 3
20μmoL/L正向引物:5 GTAAAACGACGGCCAGT 3
4.5mmoL/LdATP、dGTP、dCTP溶液,2mmoL/LdTTP溶液,0.2mmoL/L地高辛-11-dUTP(碱不稳定型),5U/μLTaq聚合酶。
