DNA探针的种类及其特点
核酸探针按性质划分可分为基因组 DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。
作为诊断试剂,较常使用的是基因组 DNA 探针和 cDNA 探针。其中,前者的应用最为广泛,它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的 DNA 后将其克隆到质粒或噬菌体载体中,随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的 DNA 探针。将 RNA 进行逆转录,所获得的产物即为 cDNA。cDNA 探针适用于 RNA 病毒的检测。cDNA 探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中,以便大量制备。
将信息 RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便,且 RNA 极易被环境中大量存在的核酸酶所降解,操作不便,因此应用较少。
用人工合成的寡聚核苷酸片段作为核酸杂交探针的应用十分广泛,可根据需要合成相应的序列,可合成仅有几十个 bp 的探针序列,对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用。
核酸探针按标记物划分可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素作为标记物。放射性同位素是最早使用,也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S,其中 32P 的应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高,可以检测到皮克级;缺点是易造成放射性污染,同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此,放射性标记的探针不能实现商品化。目前,许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。
目前应用较多的非放射性标记物是生物素(biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素,对亲和素有独特的亲和力,两者能形成稳定的复合物,通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子,可利用其抗体进行免疫检测,原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当,而特异性优于生物素标记,其应用日趋广泛。
