基因构建策略
| 基因构建策略 |
下面我们介绍一下转基因和基因打靶载体构建策略的一般原则。 |
转基因
转基因是线性化的DN**段，通常包含一个启动子（promoter），一个cDNA，一个内含子和一个多聚腺苷酸信号，常常克隆到一个质粒载体上。当注射到小鼠受精卵的前核内时，它们整合到随机的位点，通常是包含不同的拷贝数从头到尾的多联体。大部分时候，整合发生在单个位点并且存在于整合产生的小鼠的所有细胞中。在小部分情况下，小鼠可能有多个整合位点，或者只在部分细胞中含有转基因。
当使用cDNA的时候，加入一个人工合成的内含子刺激mRNA运输出细胞核，因为这个过程是和选择性剪切过程相偶联的。人造内含子应该置于cDNA的3’端。
这一主题的一些改变包括：
BAC转基因——它们允许插入整个基因，包括所有的内含子和可能的未知启动子和增强子元件，还有一些允许转基因即使整合到异染色体中都允许基因表达的“绝缘体”序列。
无启动子转基因——它们可以发挥基因捕获或启动子捕获的作用，并且通常包含lacz或GFP报告基因的cDNA。
加入IRES——内部核糖体进入位点，连同第二个cDNA一起，实现在相同启动子控制下两个蛋白的表达。第二个蛋白可以是一个报告分子例如β-半乳糖苷酶或GFP。
融合蛋白——通过与一个报告基因或一个附加的亲和标记物融合，使蛋白产物的检测更容易。
启动子
对于任意给定转基因，最好的启动子取决于研究的真正目的。
大部分转基因被设计成导致一个蛋白过量表达。因此强组成型启动子例如CMV或PGK常用于驱动所有组织中的表达。
组织特异性启动子可用于限制空间表达型式，而可诱导启动子被用于控制表达的时间，受发育调控的启动子也可以用于控制表达时间。
最常用的可诱导启动子是通过四环素或它的类似物打开或关闭的。这种所谓的Tet-On和Tet-Off载体系统可以从Clontech购买到。这个系统包括两个分别注射的转基因，而完整的系统是通过这两系转基因小鼠的交配而重建。
同源臂
同源臂和感兴趣位点中相同序列的匹配程度将有助于确定同源重组的频率。同源臂的三个最重要的特征是:
1、 长度——我们推荐的总长度大约为7kb，其中一个臂5-6kb，而另一个臂1-2kb，越长越好，但是常常被克隆载体的能力和需要维持一个可以在转染入ES细胞前线性化construct的唯一限制性酶切位点所限制。
2、 序列同源性——任何可能的时候，从将要打靶的ES细胞中或将要打靶的ES来源的小鼠系中克隆同源臂。用高保真聚合酶进行长片段PCR是亚克隆同源臂的一种有效方法。
3、 有限的重复序列——我们推荐使用在线程序——RepeatMasker，来搜索同源臂中的重复序列。应该避免大范围的重复DNA，因为这些可能导致同源重组更低的频率。
基因打靶的Construct
基因打靶Construct被设计成可以同源重组到研究者选定的特异位点内，通常具有扰乱基因以阻止功能mRNA的转录（knock out）或使基因突变（knock-in）的功能。
设计基因打靶construct以产生knock-out或knock in小鼠的方法几乎是无限的。因此，在这里我们只提供一些普遍的规则，并建议研究者在做任何克隆之前，制备第一个construct时阅读文献并向我们或其它更有经验的研究者咨询。
最简单的打靶construct包括2个长片段的基因组DNA（gDNA），叫做同源臂，分别位于一个选择标记盒的两侧。最常用的选择标记盒包括新霉素（G418）抗性基因（其它包括嘌呤霉素、潮霉素、硫鸟嘌呤抗性基因）的cDNA和控制元件。
当注射入胚胎干细胞（ES）时，携带选择标记盒的基因组DNA同源臂将会与一条染色体上和它们匹配的序列发生重组。染色体上同源区域之间的gDNA被选择标记盒和打靶construct两条同源臂之间的其它序列所取代。 当需要完全knockout的时候，中间的序列常常取代TATA盒、起始密码和一到多个起始外显子。
打靶construct也是整合到随机位点。任何整合事件，随机或特异，可以赋予细胞药物抗性。在选择条件下生长转染的细胞，挑战是在频繁随机整合的背景中筛选足够多的克隆找到稀少的同源重组。
我们推荐在所有的打靶construct都使用阳性和阴性两种选择标记盒。最常用的阴性选择标记盒包含胸苷激酶（TK）的基因。胸苷激酶（TK）的基因产物允许生长中的细胞嵌入一个有毒性的核苷酸类似物到它们的DNA，因此反向筛选这些细胞。tk盒克隆到打靶construct同源臂的外面，这样它在同源重组过程中不会包括进去。它将在随机整合的过程中整合到基因组，因此有助于反向筛选这些克隆。另一个阴性选择标记是白喉毒素A的基因，A亚基抑制蛋白合成，但是不能被其它细胞吸收。它比tk优越的地方是它发挥作用不需要在培养基中加入第二种药物。
-
企业风采
