大规模蛋白质相互作用研究方法进展（三）
图1 TAP亲和层析纯化原理[14]
注：A:标签中的ProteinA 与固化的IgG 结合缓冲液淋洗去除不能结合的杂蛋白，TEV 酶切分离ProteinA
和靶蛋白；B:利用CBP(Calmodulin binding peptide)-Calmodulin
的相互作用进一步纯化复合物，缓冲液洗去杂蛋白。加入过量的螯合剂(EGTA)螯合Ca2+，使纯化的复合物与层析柱分离。
TAP 纯化时存在蛋白污染问题，很难判断这些蛋白是真正的相互作用，还是蛋白处理过程中的副产品。为此，有人建议用三标签的方法[19]，但实验表明该法也不能排除蛋白的污染。其他标签也有应用，比较流行的是Flag[20]。GST、His6、生物素等也分别用于蛋白纯化，但由于他们有限的亲和力及较高的背景，在大规模的蛋白质相互作用研究中未得到广泛应用。选择何种标签也许是个难题，每种标签都有自身的弱点：大标签适于规模较大的相互作用研究，但可能影响蛋白的正常折叠和功能；小标签可能会更大程度的保持蛋白本身的特性，但在表达纯化时通常含量较低[21]
2.3 质谱在蛋白质相互作用分析中的应用 在蛋白质相互作用的研究中，质谱最初只是作为鉴定蛋白质的一种快速、高效的方法：混合的蛋白样品首先经过纯化分离、然后通过SDS-PAGE
将复合体中的组分分开，随后对感兴趣的蛋白进行酶解；得到的肽段在质谱中进行鉴定，从而确定样品中的目标蛋白；但由于分离方法的灵敏度及技术本身的局限，对于那些相互作用较弱、分子量较大或偏碱性的蛋白往往不能达到理想的分析效果，增加了实验结果的假阴性。定量蛋白质组技术的出现解决了这一问题，而该技术的策略正是较好的利用了质谱的高灵敏度。目前已有许多种研究蛋白相互作用的定量蛋白质组学方法，以下就稳定同位素标记方法为例进行说明。稳定的同位素之间具有“轻”、“重” 之分，而其化学性质又保持相同，这就使得有同位素标记的蛋白在分离纯化时具有相同的特性，而在随后的质谱鉴定中又能根据质量数的差异被区分开。通常采用的同位素标记为2H、13C、15N 以及
18O。加入同位素标记的方法主要分为：代谢标记法(stable isotope-labelled animo acids in
cell culture， SILAC)和化学标记法(isotope-coded affinity tagging，
ICAT)。前者是在培养细胞的过程中加入同位素标记(体内标记) ；后者则是在提取细胞内总蛋白并经过亲和纯化后加入同位素标记(体外标记)。最后两种方法都将得到的对照及实验组样品混合，进行质谱分析。由于同位素“
轻”、“重”
差异， 质谱能很容易的区分并鉴定实验组中特异的蛋白质。该方法中，亲和纯化过程是最大限度的保留实验组中的差异蛋白而非排除污染蛋白，系统本身的灵敏度在质谱分析中得到保证，这就避免了传统的定性蛋白质组技术中分离方法本身固有的局限性，大大提高了实验结果的灵敏度和准确性。Blagoev等[22]采用SILAC 策略研究了在EGF
刺激细胞后，能够与 Grb2
的SH2结构域结合的相互作用蛋白。两组细胞分别在含有不同同位素(12C-Arg,13C-Arg)的培养基中生长一段时间，EGF 刺激其中一组细胞(实验组)10
分钟，随后两组细胞同时裂解、纯化并进行LC-MS/ MS 分析。最终228
个蛋白得到鉴定，其中28 个蛋白在被刺激的实验组中表达水平明显高于对照组。这些蛋白除了已知的信号分子外，还有一些蛋白参与了信号衰减或具有细胞骨架的功能，此外还鉴定到了未知蛋白质。这表明该方法在研究信号通路中具有较大的潜力，值得一提的是，DNA、RNA、金属离子或代谢产物等小分子也参与了某些蛋白间的相互作用，进行蛋白活性的调节，或直接与蛋白质结合发挥生物学功能，酵母双杂交、TAP 等方法对这类相互作用似乎无能为力，而基于质谱的定量蛋白质组学方法则能继续发挥其自身优势。
2.4 蛋白质芯片 蛋白芯质片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素的蛋白质或其他成分与芯片作用，漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，并最终达到测定各种蛋白质功能的目的。Zhu 等[23]置备了高密度的酵母蛋白质芯片，涵盖了近5
800 种蛋白，用以研究钙调素结合蛋白。理论上蛋白芯片除了可以研究蛋白间的相互作用外，还可以研究蛋白- 脂类、蛋白- 核酸以及蛋白-
配体间的结合，但目前应用还不够广泛，仅用于CaM、磷脂相互作用蛋白、结构域之间以及抗原与抗体的相互作用研究等[23~26]。随后，Ptacek 等[27]还研究了酵母激酶的相互作用蛋白，发现了近4
000 个磷酸化反应，涉及到1 325 种不同的蛋白 。
2.5 基于生物信息学的分析方法 生物信息学的方法大都基于从已知数据库中分析比较未知蛋白的功能及其相关的相互作用蛋白，已知的数据库包括细菌、酵母的全部基因序列或已知的相互作用蛋白。比较基因簇的同源性推测蛋白功能(conserved gene
neighborhood, GN )[28~29]，相关基因具有相似的系统发生模式(co-occurrence of
genes, CO)[30]，相互作用蛋白的基因可能相互融合(gene fusion events,
GF)[31~32] 等，以这些为依据采用适合的软件就可对大规模的蛋白质－蛋白质相互作用进行分析，目前已有许多网站开发了这样的功能(表1)。生物信息学分析无需具体的实验操作，往往是在整个基因组规模上进行研究，可获得较大的信息量。另外根据蛋白晶体结构的互补性，也可以推测蛋白间可能的相互作用，但遗憾的是这些方法以基因的同源性为前提，若数据库中没有同源基因则无法比较。目前大规模研究产生的数据都没有达到饱和，整合所有的研究数据而不是分析单一的实验结果，才能得到更加清晰有用的生物学信息。值得一提的是，在细胞中有些蛋白质的相互作用是瞬时的、不稳定的，以实验为基础的研究方法很难捕捉到这种相互作用，而基于生物信息学的分析则能弥补这一不足。
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综述
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