噬菌体抗体ELISA
噬菌体抗体ELISA
噬菌体ELISA快速而便捷，尤其是因为pⅧ有多拷贝会导致信号的扩增。不过，后续的抗体检测总是要以其可溶性形式进行。
[器材和试剂]
● 96孔ELISA板，例如Nunc maxisorb442404(可自VWR购得)
● 2％M
● /Tween
● 辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗噬菌体单克隆抗体(mAb)(Amer Sham BiOSCiences)
● 3，3’，5，5’—四甲基联苯胺(TMB)液体底物系统(SigmaT—8665)
● 终止液(1mol/L H2SO4)
● 噬菌体样品
[方法]
1．按每孔100ul蛋白抗原包被微量滴定板，4℃过夜。中10ug/m1的浓度是包被抗原的标准浓度。但有时需要更高的浓度或者不同的包被缓冲液(比如碳酸盐缓冲液)。
2．弃去抗原液并用洗涤板孔2次。
3．加入200wl的2％M封闭板孔，37℃孵育2小时。
4．用洗涤板孔 3次。
5．每孔加入SOpl的4％M。
6．每孔加入50ul含噬菌体抗体的培养基上清，用移液器反复吹吸混匀，室温孵育1小时。
7．弃去溶液，用/Tween洗涤板孔3次，再用洗涤3次。
8．将HRP标记的小鼠抗噬菌体单抗用2％M按照1：5000稀释后，每孔加入100ul；室温孵育1小时。
9．弃去二抗，并用/Tween和分别洗涤3次。
10．每孔加入100ul TMB系统溶液，并在暗处室温孵育10～30分钟。数分钟内，应呈现蓝色。
11．每孔加入50～100ul终止液，终止反应。
12．在450nm处读板。
除了用噬菌体(粒)进行ELISA外，也可以用可溶性片段。在噬菌粒展示载体上抗体片段的表达受控于1acZ启动子。在无葡萄糖的条件下，可以终止1acZ启动子的代谢抑制作用，而它却可为IPTG所诱导。抗体片段的表达是以一种被动方式渗漏到上清中(部分原因是其对大肠杆菌所产生的毒性)的。应当注意的是，有些抗体片段，例如那些毒性不很大的抗体在外周质中滞留的蛋白(甚至过夜培养后)比上清中所存在的要多些。
本处所述方法取决于起始培养基中可代谢的葡萄糖量(0．1％)在诱导剂(1PTG)加入时要足够低。这可以避开所有的离心步骤并降低污染的风险。
