miRNA在性腺生殖细胞肿瘤中的研究进展
生殖细胞肿瘤（germ cell tumor，GCT）是一类多见于年轻人群的肿瘤，常发生于性腺部位（包括男性睾丸和女性卵巢），也可发生于性腺外部位［1］。GCT的病理类型包括精原 细胞瘤、胚胎癌、未成熟畸胎瘤、卵黄囊瘤、非妊娠性绒毛膜癌、混合性GCT 等。睾丸GCT（TGCT）相对多见，而卵巢GCT（OGCT）则是一类相对少见的妇科肿瘤，约占卵巢恶性肿瘤的5％，见于年轻女性及幼少女［2］。目 前，临床广泛应用的GCT 的肿瘤标志物包括AFP、β‐hCG、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）等，但其敏感度仅约50％［3］。精原细胞瘤、未成熟畸胎瘤等缺乏特异的肿瘤标志物。近年来发现，微小 RNA（microRNA，miRNA）在肿瘤的发生、发展过程中出现异常表达，并可在肿瘤细胞的增殖、迁移等过程中发挥作用。本文就近年来miRNA在 性腺GCT中的异常表达和作用机制等方面的研究进展作一综述。
一、miRNA的形成及功能
miRNA 是一类小分子非编码RNA（non‐coding RNA，ncRNA），由21~23个核糖核苷酸组成［4］。在细胞核中，其编码基因在RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，POL‐Ⅱ）的作用下转录形成初级miRNA（pri‐miRNA），Ⅲ型核糖核酸酶Drosha 酶与RNA 结合蛋白DGCR8 形成的复合物使pri‐miRNA 形成发夹状结构而成为前体miRNA（pre‐miRNA）。随后，pre‐miRNA 进入细胞质，在Ⅲ型核糖核酸酶Dicer酶的作用下形成长约22个核苷酸的miRNA双链体，再解链成为成熟miRNA［5］。成熟miRNA在细胞质中 与核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）等结合形成RNA诱导沉默复合物（RNA‐induced silencing complex，RISC）［6］，在转录后水平对基因表达进行负调控［7］。其调控有两种模式，即靶向降解或抑制mRNA的翻译过程，作用模式的选择与 miRNA及其靶mRNA的互补程度相关，接近完全互补导致靶mRNA的切割降解，部分互补则导致mRNA的翻译抑制［6］。miRNA在分泌到细胞外时 由于外泌体磷脂双分子层的包裹而免受核糖核酸酶的降解作用，故在多种体液（如血清、血浆、尿液、精液、卵泡液等）中表现出较好的稳定性，容易取样分析 ［8］。
二、miRNA在性腺GCT中的异常表达
1.性腺GCT的起源与miRNA 表达：根据细胞起源、分化程度及发育潜力等不同，GCT可分为7种类型［1］，其中常见的是Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅱ型GCT起源于原始生殖细胞，包括精原细胞瘤和 非精原细胞瘤，其中精原细胞瘤包括睾丸中的精原细胞瘤、卵巢中的无性细胞瘤及性腺外的生殖细胞瘤，非精原细胞瘤包括胚胎癌、卵黄囊瘤、未成熟畸胎瘤和非妊 娠性绒毛膜癌；Ⅲ型GCT发生在性别分化后，起源于精原细胞，表现为精细胞肿瘤。Gillis 等［9］应用以实时定量PCR 为基础的高通量筛选技术对156 种miRNA 在Ⅱ型和Ⅲ型GCT组织及细胞中的表达进行测定，发现精原细胞瘤和无性细胞瘤的miRNA表达特征基本相似，且与胚胎癌中miRNA的表达特征部分重合， 而精细胞肿瘤则呈现出完全不同的miRNA表达特征，与其起源及分化的类型相符合。
2.miRNA在性腺GCT中的异常高表达：研究发现，无论年龄、病理类型及肿瘤部位，miR‐371‐3、miR‐302/367在GCT中均存在 异常高表达［9‐13］。Palmer 等［13］研究表明，miR‐371‐3、miR‐302/367 的升高与编码基因转录的增加有关，肿瘤干细胞转录因子Nanog、TEA转录因子4（TEAD4）、八聚体结合转录因子3和4（Oct3/4）、转录因子 活化蛋白2C（TFAP2C）、SRY 相关转录因子（SOX）家族的SOX17、SOX15 在GCT 中高表达，其中SOX17、TEAD4 与miRNA 的表达水平呈正相关（P<0.05） ，Nanog、Oct3/4 在miR‐371‐373及miR‐302的编码基因启动子区域存在结合位点。信号通路异常激活和癌基因表达可能也对miR‐371‐3的表达起调控作 用。Zhou等［14］研究表明，在结肠癌细胞系Caco‐2、HCT15、RKO、SW480 和HCT116 细胞中，Wnt 信号通路激活后，β 连环蛋白（β‐catenin）进入细胞核内，与T淋巴细胞特异性转录因子（TCF）/淋巴样增强结合因子1（LEF1）家族转录因子结合形成β‐ catenin‐LEF1复合物，随后β‐catenin‐LEF1复合物特异性结合miRNA 编码基因启动子区域的3 个TCF/LEF1 结合元件（TCF/LEF1 binding elements，TBE），即TBE1、TBE3 和TBE4，从而诱导miR‐371‐3的表达。Cairo等［15］的研究则发现，在肝母细胞瘤中癌基因MYC对miR‐371‐3的表达呈现正调控作 用。
3.miRNA 在性腺GCT 中的异常低表达：let‐7 家族miRNA 是一类调控细胞增殖的miRNA。Murray 等［16］研究表明，在恶性GCT中let‐7 miRNA的9个主要成员的表达水平均下降，以let‐7e最显著。RNA结合蛋白LIN28通过结合let‐7 pre‐miRNA的终末环阻断其成熟过程，从而降低成熟let‐7 miRNA的表达水平，而成熟let‐7 miRNA又可以负反馈抑制LIN28 的表达［17‐19］。此外，长链非编码RNA（longnon‐coding RNA，lncRNA）对let‐7 miRNA的表达也有调控作用。Gao 等［20］的研究发现，在卵巢上皮性癌（卵巢癌）中，lncRNA人卵巢癌特异性转录本2（HOST2）通过抑制let‐7b miRNA 的表达从而促进肿瘤细胞的增殖和迁移。此外，Chang 等［10］对恶性OGCT 的miRNA 表达谱的分析表明，miR‐199a‐5p、miR‐202‐3p、miR‐214‐5p、miR‐513c‐5p 在恶性OGCT中的表达降低。
4.miRNA 在不同病理类型性腺GCT 中的表达差异：Murray等［12］研究表明，无论是成人还是儿童，miR‐302/367在卵黄囊瘤中表达水平的升高较精原细胞瘤更显著，可能与基因 转录增加有关。在卵黄囊瘤中高表达的10个转录因子中有9个与miR‐302/367的表达水平呈正相关，其中与锌指蛋白转录因子（GATA）结合蛋白 6（GATA6）的相关性最强，GATA6、GATA3、转录因子7类似物2（TCF7L2）、肌腱膜纤维肉瘤转录因子（MAF）在miR‐ 302/367的上游存在结合位点，而其他转录因子则通过长距离增强子作用等调控miRNA 的表达。此外，miR‐122、miR‐205、miR‐200、miR‐375 在卵黄囊瘤中的表达水平也高于精原细胞瘤，miR‐29a‐b、miR‐96、miR‐142、miR‐146、miR‐182则在精原细胞瘤中呈现出更 高的表达水平［11‐12］。
5.miRNA在铂类耐药的性腺GCT细胞中的异常表达：目前，GCT 的一线化疗方案是博来霉素+依托泊苷+顺铂（BEP）方案。顺铂耐药是性腺GCT治疗的一大难题。Port等［21］研究发现，顺铂耐药的GCT 细胞中miR‐371‐3 和miR‐520 的表达水平较顺铂敏感的GCT 细胞更高，而miR‐99a、miR‐100和miR‐145在顺铂耐药的GCT 细胞中低表达。miR‐371‐3可通过降低大肿瘤抑制因子2（LATS2）的表达水平间接破坏p53信号通路，解除p53对细胞周期的阻滞作用，促进细 胞增殖和肿瘤发生［22］，miR‐520则通过抑制肿瘤抑制因子p21的表达参与其中［21］。
三、miRNA在性腺GCT中的作用机制
1.细胞增殖及凋亡相关因子：miRNA对细胞周期蛋白的调控在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。研究表明，miR‐372、miR‐373、 miR‐302a‐d 拥有共同的关键种子区域，长度为2~7个核苷酸分子（AAGUGC），可以与靶mRNA 的种子互补区（seed complementary region，SCR）六聚体（GCACTT）互补结合，这种六聚体在一些肿瘤相关的mRNA中富集，在GCT中呈低表达状态［13］。 Voorhoeve等［22］研究发现，LATS2可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的作用从而使细胞周期停滞，miR‐372和miR‐373可 通过破坏RNA及抑制翻译的联合作用降低LATS2 的表达水平，影响p53信号通路，促进细胞增殖和肿瘤发生。Murray等［12］对卵黄囊瘤的研究显示，与miR‐302互补结合的mRNA 在卵黄囊瘤中下调，其中包括细胞凋亡调控因子半胱天冬酶8（CASP8）、WD重复蛋白33（WDR33）、推定同源结构域转录因子2（PHTF2）以及 整联蛋白B2（ITGB2）等。Das 等［23］则发现，在TGCT中抑制miR‐302的表达可显著降低凋亡抑制蛋白survivin 的表达。同样，在GCT 中表达下降的let‐7 家族miRNA，通过抑制细胞增殖调控相关蛋白的表达实现其对肿瘤的抑制作用，如MYCN、AURKB 等基因的mRNA 均是let‐7的靶标［16］。
2.信号通路：Wnt信号通路与肿瘤发生的关系密切。在Wnt信号通路中，Wnt信号通路抑制因子Dickkopf 1（DKK1）、转化生长因子β受体2（TGFBR2）、B淋巴细胞异位基因1表达蛋白（BTG1）以及左右决定因子1（LEFTY1）受miR‐ 372、miR‐373 的调控。miR‐372、miR‐373 的异常高表达可导致Wnt信号通路抑制因子DKK1 mRNA的表达水平降低，使肿瘤抑制因子TGFBR2 mRNA表达沉默，且BTG1蛋白表达下降，从而使Wnt信号通路维持激活状态［14］。有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号调节激酶 （ERK）信号通路则可因miR‐302表达的升高促进ERK1/2的磷酸化而被激活［23］。Fustino等［11］发现，与精原细胞瘤相比，在卵黄 囊瘤中异常高表达的23种miRNA的靶标均可在骨形态发生蛋白（BMP）信号通路中富集，其中miR‐200可抑制BMP信号通路抑制因子Noggin 蛋白的表达，维持BMP信号通路的激活状态。
miRNA种类繁多，作用机制复杂，在不同细胞背景下相同的调控因子也可能表现出不同功能，其作用机制尚未完全明了，有待进一步探索。
四、miRNA在性腺GCT中的临床应用展望
现阶段，miRNA 在性腺GCT 中的临床研究大多以TGCT为对象。van Agthoven和Looijenga［24］的研究采用放大靶向血清miRNA 检测方法（amplification targeted serum microRNA，ampTSmiR）检测TGCT 患者及健康男性对照血清中miRNA 的表达水平，结果发现，TGCT 患者的血清miR‐371a‐3p、miR‐373‐3p 和miR‐367‐3p 水平升高，对于TGCT 诊断的敏感度达90％。另有研究表明，血清miR‐371a‐3p、miR‐373‐3p和miR‐367‐3p水平的异常升高在发现肿瘤残留灶及预测复 发方面比现有的肿瘤标志物更加敏感［25‐26］ 。Le?o 等［27］ 研究表明，TGCT 患者的血清miR‐371a‐3p、miR‐373‐3p和miR‐367‐3p水平可反映其临床期别和治疗效果；其中miR‐371a‐3p在GCT诊 断中的敏感度最高［28‐29］。Dieckmann等［28］的研究纳入了616例TGCT患者和258例对照（包括睾丸良性疾病患者133例、健康男 性志愿者125例），结果显示，血清miR‐371a‐3p水平诊断TGCT的敏感度为90.1％，特异度为94.0％，受试者工作特征曲线下面积 （AUC）为0.966，而AFP、β‐hCG和LDH 3种传统肿瘤标志物联合检测诊断TGCT 的敏感度仅为50.0％；血清miR‐371a‐3p水平的升高程度与TGCT的临床分期、肿瘤直径相关，化疗或手术治疗后血清miR‐371a‐3p 水平下降明显，因而在疗效评估上有参考价值。Badia 等［30］的研究发现，血清miR‐371a‐3p水平对于预测TGCT患者残留灶的特异度为100％，敏感度为93％。此外，miR‐371a‐3p对 预测疾病复发的敏感度也优于传统肿瘤标志物检测和影像学检查［28，31‐32］。在预后分析方面，血清miR‐371a‐3p水平相对较低的患者预后较 好，治疗前血清miR‐371a‐3p水平较低的患者其总生存时间和无进展生存时间均更长［33］。现已有2项前瞻性随机临床试验将miR‐371‐3、 miR‐302/367在TGCT中的表达水平纳入了研究中［34‐35］，分别是美国儿童肿瘤协作组（COG）发起的AGCT‐1531 研究和美国西南肿瘤协作组（SWOG）发起的SWOG‐S1823研究，若能在此类临床试验中证实miRNA可作为肿瘤标志物，即有望在未来进入临床应用 之中。
OGCT与TGCT在细胞起源、生物学行为及临床诊疗方案方面都有共同之处，但目前miRNA在OGCT中的表达与应用仍在研究当中，暂无关于 miRNA在OGCT患者血清中异常表达的研究，这与OGCT病例数量较少、取材较困难等因素可能有关。随着检测技术的发展和对疾病认识的不断深入，未来 miRNA可能成为OGCT研究的重要方向之一，在OGCT的临床诊断、疗效评估、随访监测等方面都将起到重要作用。
总之，miRNA 的异常表达与性腺GCT的发生、发展密切相关。由于细胞起源以及分化程度不同，不同病理类型的GCT的miRNA表达特征不同。miRNA在GCT中的异 常表达与基因转录增加、信号通路激活以及癌基因的调控相关，同时miRNA通过对细胞增殖及凋亡因子、信号通路等的作用参与肿瘤细胞的增殖、迁移等过程的 调控。miR‐371‐3、miR‐302/367 在GCT 组织和患者血清样本中均存在异常高表达，其中miR‐371a‐3p最突出，在GCT的诊断、疗效评估、随访监测、预后分析中均优于传统手段，有望成为新 型肿瘤标志物。在铂类耐药的GCT细胞中miRNA的异常表达也为疾病的分子诊疗和药物研发提供了新的思路和方向。然而，现阶段对于miRNA在GCT中 的研究多集中于TGCT，单独针对OGCT中miRNA的研究不多，有待进一步探索。
