PNAS | 单细胞测序新技术揭示了这种有害线粒体DNA突变
线粒体功能下降是衰老和年龄相关疾病的基础，但线粒体DNA (mtDNA)突变在这些过程中的作用仍然难以捉摸。为了研究mtDNA突变的模式，在单细胞水平上量化mtDNA突变及其相关的致病效应尤为重要。然而，现有的单细胞mtDNA测序方法由于成本高和mtDNA靶率低而效率低下。
2022年12月28日，康奈尔大学顾正龙教授（现就职于复旦大学和粤港澳大湾区精准医学研究院）团队（天津工业生物技术所郭晓贤副研究员及康奈尔大学徐伟林博士为该论文的共同第一作者）在PNAS 在线发表题为“High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level”的研究论文，该研究开发了一种具有成本效益的mtDNA靶向测序方案，称为单细胞多重探针靶向扩增测序(scSTAMP)，并通过实验验证了其可靠性。然后，该研究评估了一名76岁女性768个B淋巴细胞和768个单核细胞中的单细胞mtDNA突变。在632个mtDNA覆盖率超过>100×的B淋巴细胞和617个单核细胞中，结果表明，超过50%的细胞携带至少一种mtDNA突变，变异等位基因频率(VAFs)超过20%，B淋巴细胞和单核细胞平均携带这种突变分别为0.658和0.712。
令人惊讶的是，在两个细胞群中，超过20%的观察到的突变具有超过90%的VAFs。此外，60%以上的突变发生在蛋白质编码基因中，其中70%以上为非同义突变，50%以上的非同义突变被预测为高致病性突变。此外，约有80%的突变位点仅在单一细胞中检测出，表明高频mtDNA突变在衰老个体的细胞中广泛存在。总之，该研究结果显示，具有功能意义的mtDNA突变可能在老年时普遍存在，需要在单细胞水平上进一步研究与年龄相关的mtDNA突变动态。
线粒体通过氧化磷酸化为细胞代谢提供超过90%的ATP，同时在凋亡调控、免疫反应、信号传导、生物质合成、胞质钙离子调节等众多细胞功能中都具有重要作用。作为人体细胞中唯一拥有独立遗传体系的细胞器，其遗传物质线粒体DNA（mtDNA）的变异是很多疾病的导火线，也与衰老密切相关。单个细胞含有成百上千个线粒体，单个线粒体内又可携带多个拷贝的mtDNA，因此，单一细胞内的mtDNA突变后经常与野生型mtDNA共存，这种现象被称为mtDNA异质性。
常见的致病性mtDNA突变多以异质性形式存在，只有在异质性达到某一阈值后才会引发明显症状。传统的测序技术多以多细胞混合样品建库，单个细胞独有的mtDNA突变因被掩蔽而无法获得准确地检测，已有的单细胞测序技术成本较高，且在mtDNA扩增过程中往往伴随等位基因丟失，难以实现深度mtDNA覆盖。
为深入认识衰老个体细胞内mtDNA突变的分布及其对细胞功能的影响，研究者首先开发了一种单细胞线粒体全基因组高效特异扩增方法，并基于原创的STAMP(Sequencing by Targeted Amplification of Multiplex Probes)技术进一步研发出低成本的单细胞mtDNA深度测序技术——scSTAMP（单细胞多重探针靶向扩增mtDNA测序）。单细胞一分为二平行测序所获得的一致性突变频谱，表明scSTAMP技术在检测单细胞水平的mtDNA异质性突变中，具有高度的准确性与灵敏性。
线粒体DNA测序揭示单细胞水平存在大量高频率和功能性mtDNA突变（图源自PNAS ）
研究者对分选自一位76岁健康女性血液中的B细胞与单核细胞进行大规模单细胞mtDNA测序分析，发现随机分选的1249个细胞中，超过一半的细胞都携带异质性大于20%的mtDNA突变，在所有检测到的突变位点中，超过20%的异质性频率甚至高于90%，两种细胞群体都携带高比例(占蛋白编码基因突变比例高于75%)的错义异质性mtDNA突变。根据CADD(Combined Annotation Dependent Depletion)算法，对错义异质性mtDNA突变的危害进行致病性评分，发现B细胞与单核细胞中分别有52.2%和59.6%的错义突变评分大于20，表明这些突变具有较高的致病性。此外，约有80%的突变位点仅在单一细胞中检测出，表明高频mtDNA突变在衰老个体的细胞中广泛存在。
总之，该研究不仅为线粒体遗传模式研究提供了新的方法，同时也揭示了衰老细胞中高频率和功能性mtDNA突变广泛存在，提示潜在致病的mtDNA突变有可能促进细胞及个体的衰老。
