淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术（二）
2. HAT选择杂交瘤
一般在融合24 小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1 ml加入50 ml20 ％小牛血清完全培养液中。
因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200 μl/孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择，可得到满意的筛选结果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
三、抗体的检测
筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有
1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。
2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
3. FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。
可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
四、杂交瘤的克隆化和冻存
克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
1. 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
（1）有限稀释法的程序
①制备饲养细胞悬液（同融合前准备）
②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×103 /ml
③取130 个细胞放入6.5 ml含饲养细胞完全培养液，即20 个细胞/ml，100 μl/孔加A、B、C三排为每孔2 个细胞。余下2.9 ml细胞悬液补加2.9 ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10 个/ml，100 μl/孔加D、E、F三排，为每孔1 个细胞。余下2.2 ml细胞悬液补加2.2 ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5 个/ml，100 μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5 个细胞。
④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200 μl/孔。
⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
（2）软琼脂法
①软琼脂的配制
含20 ％FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640
1 ％琼脂水溶液：高压灭菌，42 ℃预热。
0.5 ％琼脂：由1份1 ％琼脂加1份含20 ％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42 ℃保温。
②用上述0.5 ％琼脂液（含有饲养细胞）15 ml倾注于直径为9 cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
③按100 /ml，500 /ml或5000 /ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
④1 ml 0.5 ％琼脂液（42 ℃预热）在室温中分别与1 ml不同浓度的细胞悬液相混合。
⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10 分钟，使其凝固，孵育于37 ℃，5 ％CO2孵箱中。
⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
2. 杂交瘤细胞的冻存
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。
细胞冻存液：
50％小牛血清
40％不完全培养液
10％DMSO（二甲亚砜）
冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0 ℃，再降温时一般按每分钟降温2～3 ℃，待降至-70 ℃可放入液氮中。或细胞管降至0 ℃ 后放-70 ℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
五、单克隆抗体的大量生产
大量生产单克隆抗体的方法主要有两种
1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60 μg/ml，如果大量生产，费用较高。
2. 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
（1）实体瘤法
对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107 /ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml， 共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10 mg/ml。但采血量有限。
（2）腹水的制备
常规是先腹腔注射0.5 mlPristane（降植烷）或液体石腊于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10 ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20 mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
六、单克隆抗体的鉴定
对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定
1. 抗体特异性的鉴定
除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如
（1）制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。
（2）制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。
2. McAb的Ig类与亚类的鉴定
一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3 ％），将有利于沉淀线的形成。
3. McAb中和活性的鉴定
用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。
4. McAb识别抗原表位的鉴定
用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。
5. McAb亲和力的鉴定
用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。
