cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成
构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组,基因克隆的重要方法,而在该文库构建中有mRNA
逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA，在这个逆转录过程中，模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mRNA来讲，一是丰度，二是纯度，丰度愈高，纯度越好，合成效率越好。在逆转录酶作用下，以Oligo(dT)或寡聚６核苷酸(随机)为引物，进行cDNA第一链的合成。而第二链的合成有自身引物合成,外加引物合成及置换合成,本实验采用置换合成法进行,即在RNaseH作用下，部分降解RNA，再用DNA多聚酶Ⅰ产生的DNA片段取代，以合成第二条链。
一：仪器：
恒温水浴,离心机、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪
二：试剂：
cDNA合成试剂盒、饱和酚、氯仿/异丙醇、EDTA、乙醇、3M NaAC pH 5.2、TE缓冲液
三：操作
１：第一链的合成：
a:在灭菌的DEPC处理Eppondef管中,分别加入:
模板样品mRNA 1μg
引物(0.5μg/μl) 1μl（6碱基随机引物 或oligdt）
加水至10μl
b:70℃5-10分钟,冰浴冷却5分钟
c:在上管中，根据下表依次序分别加入
5×第一链缓冲液4μl
核酶抑制剂40μ
40mM焦磷酸钠2μl
AMV反转录酶20 μ
加水至20μl
d:敲打混合,离心后放于37℃或42℃60分钟。
e:反应完毕后,将反应管置于冰浴。用于第二链合成。
注：引物可为特异引物（构建特异文库）、olig0(dt)15引物或6核苷酸随机引物，但不同引物RT时温度不同，前两种在42℃下进行，而随机引物则在37℃下进行。
２：第二链的合成
a:第一链合成完毕后，直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入
2.5×第二链缓冲液40μl，
DNA聚合酶Ⅰ23μ
RNase H 0.8μ
加水至100μl
b: 14-１６℃下放置2小时。(>3Kb时反应时间延长至3-4小时)
c：70℃，10min，点动离心,置于冰浴
d: 在样品管中加入T4DNA聚合酶2μ,37放置１0分钟。
e：加入4μl 500mM的EDTA到该样品管中,然后置于冰浴上.
f: 等体积加入酚\氯仿\异戊醇抽上清,12000g，3min。
g: 上清液转移至一干净试管,加2V乙醇,1/10V乙酸钠，-20℃30min沉淀,12000g，15min收集沉淀，70%乙醇洗沉淀,干燥,TE复溶。
合成后的cDNA链既可经与一定的通用接头连接后,生成末端序列,也可通过一定的内切酶处理,形成一定序列的末端片断,然后（1）与未端有互补序列的λ臂-DNA连接，形成重组λ-DNA,再经体外包装形成完整λ噬菌体，经转染后,生成噬菌体cDNA文库.（2）与未端有互补序列的质粒载体连接，形成重组质粒DNA,
生成质粒cDNA文库。目前经常使用的一些载体已经商品化,商品化的λ载体主要有噬菌体左右臂、复制原点及启动序列构成,其在连接酶作用下,可直接于具相同末端序列的cDNA互补连接。cDNA末端序列的产生可通过1)可添加核苷酸后酶切；2)直接加商品接头而形成与相应噬菌体左右臂相互补的序列。不同载体有不同的末端序列,有不同的宿主菌,有不同的筛选方式,因此在进行文库包装时,一定要搞清楚这些情况,以有的放矢的进行工作.
