实时荧光定量PCR基本原理
• Taqman 技术：该技术以美国 ABI 公司为代表。 PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， PCR 仪检测不到荧光信号； PCR 扩增时（在延伸阶段）， Taq 酶的 5' － 3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。
• Beacon 技术：该技术以美国人 Tagyi 为代表。也是加入了荧光探针，但它是 环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成， 两端分别标记 荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在 PCR 的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。
• FRET 技术：该技术以 Roche( 罗氏公司 ) 为代表。它的基本原理是：两条直线型寡核苷酸探针，其中一条的 3 ‘端标记荧光激发基团，另一条的 5 ' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在 PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。
实时 PCR 中的几个俗语
• Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
• 荧光域值（ threshold ）：是指 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即： threshold
• Ct 值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔 1 〕，起始拷贝数越多， Ct
值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样品的
Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
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