重组MVA活体免疫染色实验
实验方法原理 活体免疫染色可用于检测改造的痘苗病毒Ankara （MVA），因为MVA不能形成分开的、易辨认的噬斑，并且这种技术不需要利用筛选的标记基因。
实验材料 汇片生长的CEF细胞
试剂、试剂盒 完全 MEM-2、MEM-2.5 和 MEM-10 培养基转染细胞裂解液干冰／乙醇抗外源基因表达蛋白一抗辣根过氧化物酶联二抗
仪器、耗材 刀豆蛋白 A 包被的 6 孔组织培养板杯状超声仪 倒置显微镜无菌牙签细胞刮刀／1 ml注射器的活塞75 cm2、150 cm2 组织培养瓶
实验步骤
1. 胰酶消化汇片生长 CEF 细胞，将其放入刀豆蛋白 A 包被的 6 组织培养板中培养，直到细胞生长至汇片。
2. 取出转染细胞裂解液置于冰上，在杯状超声仪上以最大功率超声 30 s。分别将含有 100、10、1、0.1 μl 细胞裂解液的 2 ml 完全 MEM-2.5 培养基加入每个孔中，每种浓度重复加入两个孔中，轻轻摇晃混匀，培养 2 天。
3. 用抗外源基因表达蛋白的一抗对没有进行固定的细胞进行免疫染色。
4. 吸出培养基，在倒置显微镜下观察细胞，用无菌牙签挑取免疫染色点，折断牙签，将牙签的无菌部分分别装入含有 0.5 ml 完全 MEM-2.5 培养基的小瓶中。
5. 反复冻融法裂解细胞悬液：用干冰/乙醇冷冻细胞，再用 37℃ 水浴及涡旋使细胞解冻。如此进行 3 次。在杯状超声仪上以最大功率超声 30 s。
6. 再将其感染新的 CEF 细胞，按照步骤 2～5 进行重组 MVA 病毒的第二轮噬斑纯化，再进行三轮噬斑纯化。
7. 用 0.25 ml 噬斑纯化重组病毒 MVA 感染在用刀豆蛋白 A 包被的 6 孔组织培养板中一个孔中培养的 CEF 或 BHK-21 细胞，加入 MEM-2.5 培养基至 2 ml。培养 2 天。
8. 吸出 1 ml 覆盖细胞的培养基，用细胞刮刀（或 1 ml 注射器的活塞）使细胞进入剩余的 1 ml 培养基中，转移到小瓶中。按步骤 5 反复冻融细胞获得细胞裂解液。
9. 将 0.5 ml 细胞裂解液接种到在含有 15 ml MEM-2.5 培养基的 75 cm2 培养瓶培养的 CEF 和 BHK-21 细胞上，扩增病毒。2 天后，按步骤 8 收获、裂解细胞。
10. 用 0.5 ml 来自步骤 9 的细胞裂解液接种在含有 30 ml MEM-2.5 培养基 150 cm2 培养瓶培养的 CEF 和 BHK-21 细胞。
11. 测定病毒滴度，制备大量的重组病毒 MVA 储液，分成小份，-70℃ 保存。
注意事项
1. 如果目的蛋白在细胞内表达，吸去孔中的溶液，将培养板于 -70℃ 放置 1 h。解冻并进行染色，这一步骤使细胞在原位破裂，使抗体渗透。
2. 本实验方案中，噬斑纯化用液体代替琼脂糖作为覆盖层，有利于免疫染色。为了检测稳定性和纯度，用另一块培养板进行免疫染色。没有被染色的点是由于野生病毒或不稳定的重组而引起的细胞病变导致的。
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精英视角
