DNA重组实验方法
[实验原理]
DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5'端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12-16℃，反应12-16小时 (过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．恒温摇床
2．恒温水浴
3．恒温培养箱
4．小型高速离心机
(二)材料
1． 氨苄青霉素
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA连接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 质粒
6． 培养皿
7． 接种针
8． 金属涂棒
9． 1.5mL 离心管
10．酒精灯
11．镊子、灭菌牙签等
(三)试剂
DNA琼脂糖胶纯化试剂盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申能博彩公司）
[实验步骤]
(一)质粒DNA
用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。
(二)制备重组DNA
1．在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE-31质粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。
2．在另一无菌1.5mL 离心管中，加pUC18-CAT 质粒20mL，加入3mL酶切反应液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37℃反应过夜。
3．反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否完全。酶切完全，进行下一步。
4．将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。
5．将回收的pQE-31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。操作如下：
在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL，T4 DNA连接酶1mL，14℃（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。
(三)转化感受态细胞
1．用实验一制备的感受态细胞(-20℃保存的)。
2．在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。
[实验结果]
过夜培养后，实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。
附：试剂盒说明书
3S Spin DNA Agarose Gel purification Kit
试剂盒组成：
| 试剂盒组成 | K131(50次) | K132(100次) | K133(250次) |
|
3S Co1umn Collection Tube Solution SN Solution B Wash Solution(a) TE 说明书 |
50支 50支 30m1 10m1 22m1 10m1 1份 |
100支 100支 60m1 10m1 2X 22m1 10m1 1份 |
250支 250支 150m1 25m1 5X 22m1 10m1 1份 |
注：
(a)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混匀后使用。每次
使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash So1ution中的乙醇含量。
(b)TE pH8．0或者水均可以用于洗脱，测序样品请用水洗脱。
试剂盒DNA回收率：
3S柱对100bp以上的DNA片段有较好的结合性能和回收率，回收率在60％以上。
主要用途：
(a)TBE或TAE Agarose胶中回收DNA片段。
(b)从溶液中回收和浓缩DNA，去除反应体系中的蛋白质。
操作步骤
从Agarose胶中回收DNA：
1．用Agarose胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下要回收DNA的琼脂块，放入1．5m1离心管中。判定DNA 片段的位置时，要尽可能使用长波长UV，在UV下照射的时间应尽可能短。
2．按每100mg Agarose胶加入400ml Solution
SN，置于55-65℃水浴中5分钟，中途混匀，至胶完全融化。胶融化后每400ml Solution SN加入100ml So1ution
B，混匀。注意；高浓度的胶(1．5-2％)，每100mg胶加入500ml Solution
SN，加热融胶的时间延长到15分钟，以保证胶全部融化，胶融化后加入100ml SolutionB，混匀。
3．将3S柱放入2m1收集管中，将融化的胶溶液转移到3S柱中，让盖子开着，室温放置2分钟。盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温离心(10，000rpm)1分钟。
4．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，加入600ml Wash Solution，室温离心(10，000rpm)1分钟。
5．重复步骤4一次
6．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，室温高速离心(10000 rpm)2分钟。
7．将3S柱放入一根新的1．5m1离心管中，在3S柱子膜中央加入30ml TE或水，室温放置2分钟。注意：提高洗脱温度有利于提高DNA的洗脱效率。也可以用预热的TE或水洗脱。
8．盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，10，000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
从溶液中回收和浓缩DNA：
1．根据溶液的体积和所要回收DNA的含量，加入5倍体积的Solution SN。如果溶液的体积不足100ml，加TE补足到100ml，再加500u1 Solution SN和100 ml SolutionB，混匀；
2．以下同从Agarose胶中回收DNA的步骤3-8。
