基于 AFLP 的转录表达谱分析（二）
19. 取 10 ml 反应混合物和分子质量参照物一起电泳，检查预扩增的情况。 应该看到位于 50～500 bp 之间的，呈拖尾状的弥散产物。
20. 按 1：500 稀释 2 ul 非选择性的预扩增cDNA片段（也就是＋0/＋0）到Tris· Cl （pH 8. 0）/0.1 mmol/L EDTA。
21. 在一个适合于 PE-9600 的热循环仪的 PCR 板上准备选择性预扩增反应（＋1/＋1）：
21.1 分装 5 ul 1：500 的非选择性预扩增 cDNA 片段到 PCR 板上的前两列（1和2）的每一个孔中。
21.2 分装 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 T 叫 TaqⅠ+A 到 A1 至 D1 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+C 到 E1 至 H1 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ＋G 到 A2 至 D2 的孔中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 TaqⅠ+T 到 E2 至 H2 的孔中。
21.3 分装 1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ＋A 到 A1、A2、E1 和 E2 中，1.5 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseⅠ＋C 到 B1、B2、F1 和 F2 中，1.65 ul 的 8 pmol/ul 的引 物 MseI＋G 到 C1、C2、D1 和 D2 中，1.4 ul 的 8 pmol/ul 的引物 MseI＋T 到 D1、D2、H1 和 H2 中。
21.4 混合 32 ul 5 mmol/L dNTP， 80 ul 的 10× PCR 缓冲液 ，16 U 的 AmpliTaq-Gold 聚合酶，用水调整体积到 672 ul，配制成 dNTP/聚合酶混合液。
21.5 分装 42 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前两列的每个孔中。
22. 运行下面的降落： 温度循环程序进行 AFLP 扩增：
13 轮：
30 s 94°C（变性）
30 s 65°C- 0.7°C/轮（引物复性）
60 s 72 0C （引物延伸）
20 轮：
30 s 94°C（变性）
30 s 56°C（引物复性）
60 s 72°C（引物延伸）
23. 准备下面的磷酸化反应混合物：
2.0 ul 10 uCi/ul （约 2000 Ci/mmol） ［33P-γ］ ATP
1.0 ul 10× T4 多核苷酸激酶缓冲液
4 U T4多核苷酸激酶
加水到 8 ul。
24. 混合 2.0 ul 8 pmol/ul 的选择性引物（＋2）和 8 ul 的磷酸化反应混合物（步骤 23），磷酸化 16 pmol的选择性 TaqI＋2 引物（20 个 AFLP 反应所需的量；也就是，对一个给定的 TagI＋2 引物，整套 256 种引物组合种所有 16＋2/＋2 的反应所需的量），产出的标记引物浓度为 12.6 pmol/ul， 终体积 10 ul。37°C 温育 60 min，随后 70°C 加热 10 min 失活激酶。
25. 把 2 ul 各个预扩增产物（＋1/＋1；22 步）用 Tris·Cl （pH 8.0）/0.1 mmol/L EDTA 稀释 500 倍。在一个适合于 PE-9600 的热循环仪的 PCR 板上准备选择性扩增反应（＋2/＋2）：
25.1 分装 2 ul 1：500 的预扩增混合液 TaqI＋A/MseI＋C 到 PCR 板上的前两列。
25.2 分装 0.5 ul 标记的引物：TaqI＋AA 到 A1 至 D1 的孔中，0.5 ul 标记的引物 TaqI＋AC 到 E1 至 H1 的孔中，0.5 ul 标记的引物 TaqI＋AG 到 A2 至 D2 的孔中，0.5 ul 标记的引物 TaqI＋AT 到 E2 至 H2 的孔中。
25.3 分装 0.6 ul 未标记的引物 MseI＋CA 到 A1、A2、E1 和 E2 孔中，0.6 ul 未标记的引物 MseI＋CC 到 B1、B2、F1 和 F2 孔中，0.6 ul 未标记的引物 MseI＋CG 到 C1、C2、D1 和 D2 中，0.6 ul 未标记的引物 MseI＋CT 到 D1、D2、H1 和 H2 中。
25.4 混合 12.8 ul 5 mmol/L dNTP， 32 ul 的 10×PCR 缓冲液，6.4 U 的 AmpliTaq- Gold 聚合酶，用水调整体积到 270.4 ul， 配制成 dNTP/聚合酶混合液。
25.5 分装 16.9 ul 的 dNTP/聚合酶混合液到前两列的每个孔中。
26. 按照步骤 22 中的「降落」 PCR 程序扩增产物。
27. AFLP 反应中加入等体积（20 ul）的上样缓冲液。90°C 加热 3 min 变性 AFLP 反应产物，然后快速置于冰上冷却。
28. 测序凝胶系统的后玻璃板用 2 ml 排斥型硅烷处理，前玻璃板用 10 ml 的黏合型硅烷处理。准备 4.5％ 的变性聚丙烯酰胺凝胶（约 100 ml）。
29. 用 1×TBE 作电泳缓冲液，上样前预电泳 0.5 h， 使用合适的电泳条件使凝胶加热到约 55°C （如对 BioRd 系统固定 110 W）。用温度计监测凝胶的温度。
30. 每孔上样 3 ul（48 道的凝胶）或 1.5 ul（96 道的凝胶）的样品，约 55°C 电泳分析。 如果需要的话，加上一个分子质量参照物（如 SequalMark 10-base 序列阶梯）。
31. 电泳完成后，卸下凝胶。因为硅胶的处理，凝胶会黏附在前板上。凝胶浸泡在 10％ 的乙酸里 30 min 以固定凝胶。用水彻底淋洗凝胶，在通风橱里室温干燥 10～21 h， 或使用较高温度 （如使用温度浴）干燥较短时间直到凝胶不再发黏。
32. 放射自显影或用磷屏显示凝胶分离的 cDNA 片段。
收起
注意事项
1. 所有接触RNA的溶液和材料必须是无RNase的，RNA的操作必须使用正确的操作技术。
2. 供应商和品牌一般不是十分重要，然而当遇到问题的时候，建议至少使用推荐商标的逆转录酶（SuperScript II）和 Taq 聚合酶（AmpliTaq 和 AmpliTaq-Gold）。
3. 当准备 AFLP 扩增的时候，建议尽可能使用混合好的试剂混合液。使用试剂混合液有助于配制反应，也非常有助于结果的可信度和重复性。在实际操作中，混合液的配制因实验而定，即确定哪一个成分在一系列反应中是不变的：模板还是引物的组合（例如，一个样品和许多不同的引物组合，许多样品和一个引物组合）。
4. 甲酰胺是有害的，在通风橱里进行这一步操作。
5. 放射性物质需要特殊的操作。
其他
1. 材料
Total RNA
2. 试剂
5' 生物素化的 dT25（5-生物素-dT25）
1× 和 2× 结合缓冲液 H2O： Milli-Q 纯化的水（也就是经过五级Milli-QPhis系统处理的去离子水；Milipore）或双蒸水
链霉亲和素包被的磁珠（Dynal）
洗涤缓冲液
2 mmol/L EDTA，pH 7.5
5× 第一链缓冲液
5× 第二链缓冲液
0.1 mol/L DTT
5 和 10 mmol/L（每个）4 dNTP 的混合物（Amersham Pharmacia Biotech)
SuperScript II （Life Technologies）
E.coli DNA 连接酶（Life Technologies）
E.coli DNA 聚合酶 I （Pharmacia Biotech）
RNase H （Pharmacia Biotech）
1× 和 2×STEX
10 mmol/L Tris· Cl，pH 8. 0/0.1 mmol/L EDTA
TagI 限制性内切核酸酶（New England Biolabs）
5×RL缓冲液
MseI 限制性内切核酸酶（New England Biolabs）
50 pmol/ul 带 TagI 黏性末端的连接子
750 pmol/ul 带 Msd 黏性末端的连接子
10 mmol/L ATP （Amersham Pharmacia Biotech）
T4 DNA 连接酶（Amersham Pharmacia Biotech）
8 pmol/ul AFLP＋0 （非选择性）引物（见寡核苷酸和双链连接子的说明）：TaqI＋0 和 MwI＋0 引物
10×PCR 缓冲液
Ampli Taq DNA 聚合酶（Perkin-Elmer）
10 uCi/ul （约 2000 Ci/mmol）［33P-γ］ATP （Amersham Pharmacia Biotech）
10× T4 多核苷酸激酶缓冲液
T4 多核昔酸激酶（Amersham Pharmacia Biotech）
8 pmol/ul AFLP+1 和 +2 （选择性）引物（见寡核苷酸和双链连接子的说明）： Ta9I+1 和 +2 和 MseI＋1 和＋2 引物
Ampli Taq-Gold 聚合酶
加样染料
硅烷（Amersham Pharmacia Biotech）
黏合硅烷溶液，新配制：在 10 ml 的乙醇里混合 30 ul 的黏合硅烷（Amersham Pharmacia Biotech） 和 30 ul 冰醋酸
4.5％ 的变性聚丙烯酰胺凝胶
1× TBE 分子质量标准物（如 SequalMark 10-base ladder； Reserch Genetics；可选）
10％ （V/V）乙酸
3. 耗材
微量离心管，无 RNase
磁座（MPC； Dynal）
PE-9600 热循环仪（Perkin-Elmer）和 PCR 板
测序凝胶系统（如 BioRad 38× 50× 0.04 cm SequiGen 测序凝胶系统）
磷屏（Fujix BAS 2000，Molecular Dynamics STORM 824）
