海洋被子植物Zostera marina的PSI中依赖于NDH高效的环式...-2
—— 材料和方法 ——
植物材料
在位于中国山东半岛北侧的荣成(37°16′N, 122°41′E)3
m深度的次潮汐海草床上采集到根茎系统完整(6-9节间)的健康大叶藻。在2019年5月连续几天的下午晚些时候进行采样。大叶藻在实验前在过滤海水水族馆预培养3天，在15℃和100μmolm-2s-1，以10:14-h的光：暗周期进行照明。根据最小饱和光强度，照明由A型LED灯提供，色温范围6000
K。从叶鞘上方2厘米处采集叶片进行实验测量，以保持相同的年龄。
进化分析
基于29个NDH亚单位的串联序列，采用MEGA
5.0程序构建系统发育树，并进行了1000次重复的bootstrap测试。这30个物种的所有这些序列都是通过BLASTP分析从国家生物技术信息中心(NCBI)检索到的。交互式生命树(https://
url .embl.de/)用于对树进行注释和修饰。
光处理和抑制剂处理
暗适应过夜的大叶藻暴露在三种不同的光强度，50,300和600μmolm-2s -
1反应3小时。这些处理在下文称为弱光（LL）、中光（ML）和强光（HL），它们通过德国DUAL-PAM-100来测量最小饱和光强来确定。所有处理均在光照培养箱(GZP-250N，上海森欣实验仪器有限公司)中进行，控制海水温度为15℃，模拟其在自然环境中的生长状态。光由A型LED灯提供，色温范围6000
K。在测定荧光动力学之前，随机选取暴露于光照下的叶片，每隔20分钟至暗适应15分钟。Antimycin A (AA,
Sigma)和rotenone
(Aldrich)分别用于抑制PGR5/L1和NDH依赖的PSI-CEF。分别以甲醇和二甲亚砜为溶剂，制备了AA和鱼藤酮原液。处理后样品的溶剂浓度低于1%
(v/v)。叶片使用过滤海水或含1μM AA, 150μM鱼藤酮的海水进行饱和，并在光处理之前，在15℃的黑暗条件下孵育叶片1 h。
叶绿素A荧光和P700测定
利用DUAL-PAM-100测量系统同时测量叶绿素a荧光和P700+吸光度变化。在微弱的调制光下（5μmol m-2s-1）测量出最小荧光值（Fo）后，分别对暗适应和光适应条件下的叶片在300ms的饱和脉冲光下（16000μmol
m-2
s-1）测量Fm和Fm’。Fs是光照条件下的稳态荧光值。P700+的信号会在最小（完全还原）和最大（完全氧化）之间变化。最大的变化在P700完全氧化状态(Pm)和一个给定的光状态(Pm’)是在远红光(250μmol
m− 2 s−1)和光化光（127μmol m− 2 s−1）预照射后由饱和脉冲光测量。PSII的最大光量子产量：Fv/Fm = (Fm −
Fo)/Fm，PSII的电子传递速率：ETRII = 0.84 × PPDF × 0.5 ×(
Fm’—Fs)∕Fm’，PSI的电子传递速率：0.84 × PPDF × 0.5 ×(
Pm’—P)/Pm，PSI-CEF：ETRI-ETRII。
暗适应样品在光化光下照射2min，在关闭AL后，我们监测了随后叶绿素荧光的瞬时增加作为NDH活性的一个指标，关闭AL后10
s内测定鼓包的初始斜率。根据Li等人的方法，在暗适应叶片中，当光诱导吸光度在830nm处发生变化时，监测P700+的还原动力学。我们测量P700的再次还原之前采用一个专用校准程序对P700信号进行归一化处理。远红光照射后10
s内测定P700+再还原半衰期缩短(t1/2)，表明PSI-CEF活性升高。
快速OJIP荧光瞬态测量
利用多功能植物效率分析法测定叶绿素荧光快速诱导曲线。由曲线得到如下数据：20
μs的最小荧光值（Fo），最大荧光值（Fm），0.3ms的荧光值（K-step，Fk），3ms的荧光值（J-step，Fj），30ms的荧光值（I-step，Fi）。为了评价PSII的活性，计算了PSII从光子吸收到系统间电子受体减少的能量守恒性能指数(势)：PIABS=4
×(Fk − Fo) × Fm × (Fm − FJ)/Fv × (FJ −
Fo)2，作为PSII供体侧指标监测的k步归一化可变荧光被计算为WK = (Fk−Fo)/(FJ−Fo)。
ECS分析
电致变色效应吸光度信号变化的测量是用DUAL-PAM-100的P515/535模块在515nm波长下进行监测。样品先暗适应15min，再在127μmolm-2s-1的光化光下照射5min，然后再进行测量。AL被关闭，记录ECS的衰变动力学，以确定总ECS，代表了总质子动能(pmf)的大小及其组成部分，即ΔpH和Δψ。ECS衰减(gH+)是通过最初的300ms响应速率到P515发射结束来估计的。
免疫印迹分析
从处理的叶片中分离出叶绿体按照是厂家的指导使用Plants Leaf Chloroplast Rude Divide
Kit测量。叶绿素含量测定采用Porra等人的方法。根据Towbin等人的描述，对NdhH、NdhS、PGR5、PGRL1、PsbO、PsbP和PsbQ(Agrisera，瑞典)的抗体进行Westernblot分析。采用Rubisco大亚单位抗体(RbcL,
Agrisera，瑞典)作为内参对照。用凝胶对x射线胶片上产生的化学发光带进行密度测量使用图像实验室软件对Doc XR+系统(Bio-Rad,
Hercules, CA, USA)进行量化。每个目标条带的总密度都是基于RbcL密度进行标准化的。
数据分析
采用SPSS 22.0统计软件包进行统计分析。所有参数均采用单因素方差分析。采用Tukey趋势检验进行事后比较。差异有统计学意义P <
0.05。使用Origin9.0程序，采用单指数函数拟合法对P700+再还原的每个点进行拟合。使用线性回归分析来评估WK，PIABS，和鼓包。
—— 结果 ——
NDH复合体的系统发生分析
基于连接的29个NDH亚基序列构建了叶绿体NDH复合体的系统发生树，显示了NDH复合序列在蓝藻、苔藓、蕨类、蕨类和石生植物中NDH复合体的系统发育关系。在蓝藻门，轮藻门和蕨类植物NDH复合物均不完整，并且部分被子植物中也缺失部分NDH亚基的。Z.marina包含五个完整的NDH亚复合物。海洋植物中除了原始藻类之外，绿藻、硅藻、红藻和褐藻等常见藻类都缺少编码叶绿体NDH复合体亚基的同源基因，这表明Z.
marina中NDH复合体的存在可能在光合作用中发挥重要作用。
图1 叶绿体NDH复合体的系统发生树
