海洋被子植物Zostera marina的PSI中依赖于NDH高效的环式...-4
随着光强的增加，OKJIP叶绿素荧光瞬态强度发生变化，说明过量辐照对PSII的性能有显著影响(图8a)。随着ML和HL暴露时间的延长，PSII的最大量子产率(Fv/Fm)和PSII性能指数(PIABS)逐渐降低(图8b, c)。此外，随着光强和照射时间的增加，K点相对荧光(WK)的荧光相对变大(图8d)，这表明PSII供体侧OEC在过量照射下持续失活。在HL和ML光照处理下，PIABS和WK之间的回归分析显示了显著的负相关(图9a)，这表明PSII活性与OEC密切相关。此外，在HL和ML处理下，光诱导的鼓包和WK之间存在显著的线性正相关(图9b)，这表明NDH依赖的PSI-CEF的激活与光诱导的OEC失活有关。
图8 a 由OJIP的ΔVt曲线对LL（50μmol m−2 s-1 灰色圆形）、ML（300 μmol m−2 s-1
黑灰方形）、HL（600 μmol m−2
s-1黑色三角形）的响应总结的叶绿素荧光动力学的变化。字母K表示JIP测试用于计算结构和功能参数所选择的时间点。每条曲线基于4次重复的平均值。b、c、d图分别是Fv/Fm、PIABS、WK在LL（黑色圆形）、ML（黑灰方形）、HL（黑色三角形）条件下随时间延长的变化过程。平均值±标准差来自4个独立样本。采用Tukey趋势检验进行显著性差异检验(在ML组与HL组中所有数据的比较P
< 0.05)。
图9 a PIABS之间的线性关系，b 经过ML（300μmol m−2 s-1）和HL（600 μmol m−2 s-1）处理后鼓包动力学曲线和Wk的标准斜率。4个独立样本均数±SD(P < 0.05)。
—— 讨论 ——
随着光照时间的延长和光照强度的升高，表征PSI-CEF活性的P700+再还原t1/2和ETRI-ETRII出现了相似的增加趋势，说明了Z.marinaPSI-CEF具有强大的能力。通过研究两种PSI-CEF通路在过量照射下的动力学，我们发现以P700+再还原t1/2为特征的PSI-CEF活性迅速增加，而以postillumination为特征的NDH依赖的PSI-CEF活性则呈现持续增加的趋势。这暗示了，优先激活的依赖PGR5/L1的通路可能无法满足光保护的需要，进而需要NDH依赖通路的逐渐激活。正如Strand等人(2016)提出的，在ATP缺失导致了NADPH在基质中的积累情况下，PGR5/L1依赖通路被迅速激活，从而恢复了ATP/NADPH的平衡。随后，长期的ATP合成不足导致PSI受体侧关闭时，NDH依赖的PSI-CEF被激活。为了验证这一推测，我们进行了Western
blot检测关键蛋白的表达。在初始照明时，PGR5和PGRL1的表达上调，而在后期照明时，NdhS和NdhH的表达上调，这证实了在过量照射下，这两种途径之间存在交替作用。因此，PSI-CEF的作用并不局限于依赖于PGR5/
l1的通路，而依赖于NDH的通路可能在持续的过度照射中发挥更重要的作用。
为了进一步说明这两种途径的交替作用，我们选择了两种抑制剂分别抑制依赖于PGR5/L1和NDH的PSI-CEF。总的来说，ΔpH和gH+在AA和鱼藤酮处理下均会降低，这表明PGR5/L1和NDH依赖的两种方式的贡献是相似的。在Z.
marina中，NDH依赖途径并不像大多数物种普遍认为的那样，是一种次要的PSI-CEF途径。值得注意的是，在抑制依赖NDH的环式电子传递途径的情况下，ΔpH在照明的初期阶段略增强，但随着暴露时间延长略有下降。这可能反映了pgr5依赖通路在光照初期的激活，以补偿减少的电子流。尽管如此,这种补偿无法产生足够的电子建立ΔpH。因此，在Z.marina中上调NDH依赖通路是导致大叶藻在高光暴露后期∆pH升高的主要原因。同时，在光照初期，AA在上ΔpH的显著抑制效果和在光照后期鱼藤酮对gH
+的显著抑制效果进一步表明两个通道之间的交替运行。此外,在我们还发现，在Z.marina中ΔpH达到最大值的时间是20分钟，而gH
+随HL时间延长逐渐下降，这暗示了ΔpH的构建能力弱和ATP合成不足。
在光照过程中，除了PSII光化学活性Fv/Fm和PIABS降低了外，以WK为特征的PSII供体侧(OEC)活性也对过量照射敏感。这与观察到的PsbO和PsbP蛋白丰度的下调是一致的。众所周知，PsbO在稳定催化Mn簇方面发挥重要作用，而PsbP和PsbQ可以诱导OEC周围的构像变化，以确保PSII中Ca2+和Cl的结合。PsbO和PsbP的下调可能导致Ca2+的释放，破坏Mn簇的结构。已有研究表明，类囊体腔的酸化可以驱动Ca2+/
H+
反向运转，维持腔内高浓度的Ca2+，从而维持OEC的稳定性。我们的相关性分析显示NDH依赖的PSI-CEF光化学活性与OEC失活之间呈线性正相关，暗示了两者之间存在着实质性的联系。大叶藻被认为至少经历了三次独立的的进化事件生活在海洋环境中。进化过程中发生了多个基因组缺失和复制事件，其中紫外光、红光和远红光光敏感蛋白受体丢失。OEC在可见光下的失活可能与这种缺失有关，因为光感蛋白受体具有重要的保护和信号传递功能。因此，光失活的OEC是大叶藻响应过度照射的核心问题，这与通常认为的光抑制有所不同。
在过量辐照下，Z.
marina中OEC的持续失活会导致PSII和PSI电子不足。NADPH作为重要的PSI电子供体， 通过膜结合的铁氧还蛋白NADP(+)氧化还原酶(FNR)传递给Fd，然后通过NDH依赖的PSI-CEF来还原PQ。在光胁迫初期，PGR5/L1依赖的PSI-CEF被优先激活，电子经由Fd传递至PQ库，而不是在基质中积累还原力。随着光照时间延长大叶藻OEC持续失活导致了水光解功能受阻，光照后期电子不足。经由PSI的有限电子可能优先通过FNR直接转移到NADP+上，产生NADPH。NDH依赖的
PSI-CEF是相应的激活，从而在过度照射条件下维持一个高ATP / NADPH比，,并且在ΔpH
、ATP和还原能力之间维持一个很好的平衡。据报道，氧化戊糖-磷酸途径可以以NADPH的形式增强还原力，在胁迫条件下支持NDH依赖的PSI-CEF的运行。此外，先前的一项研究表明，抗坏血酸(AsA)能够作为PSII的替代电子供体，可以在OEC失活情况下提供电子，支持A
. thaliana中电子传递的运行。
我们还比较了30个已完成基因组测序的物种29个叶绿体NDH复合体亚基的串联序列，研究了Z.
marina中NDH复合体蛋白编码基因的系统发育。该拓扑结构与最近NDH复合体演化研究的结论基本一致。分析发现叶绿体NDH复合体从海洋植物到陆生植物逐步完整。在海洋植物向陆地生境扩散的过程中，NDH复合体似乎参与了光合器官应对光强波动、紫外线辐射和干旱等限制的适应过程。海洋被子植物大叶藻具有完整的NDH复合体，在环境稳定的海生植物中较为少见。这种差异可能是由于其独特的进化史与陆地起源有关。
综上所述，Z. marina的特异性进化历史与其完整的叶绿体NDH复合体有关，NDH复合体能够在过量照射条件下维持高效的NDH依赖的PSI-CEF。此外，由于OEC光损伤，水光解功能受阻，总体上电子不足，电子通过PSI可能优先合成NADPH，既可满足还原力的供应和又支持了NDH依赖的PSI-CEF生成ΔpH和ATP的功能，从而维持了OEC的稳定性。
