双向电泳实验
ISO-DALT 方法
IPG-DALT 方法
| 实验方法原理 | 双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 |
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| 实验材料 | 蛋白质样品 |
| 试剂、试剂盒 | 尿素 去污剂 |
| 仪器、耗材 | 聚丙烯酰胺凝胶 |
| 实验步骤 |
一、第一向 展开 |
| 注意事项 |
在离心前，样品在SDS/溶解缓冲液中煮沸5 min，千万不要在尿素/溶解缓冲液中加热样品。在第1向电泳前离心样品。
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| 其他 |
常见问题： 1.重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？ 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 2.为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？ 通常情况下，等点聚焦中体系内除了蛋白质还会存在少量带电小分子，当这些带电小分子在电场中向两极运动时，会带动胶条中的水分子运动，水分子运动会带动附近的覆盖油移动，当样品质量不高，带电小分子较多时，会导致覆盖油移动严重溢出胶条槽，此时，通常会伴随胶条的酸性端胶条厚度增加。当发生覆盖油溢出或胶条暴露时，应及时补加覆盖油。为了防止这个现象的发生，应从样品制备时严格控制样品质量，尽量减少带电小分子如盐离子的含量。同时可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 %满）的覆盖油。 3.跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压（50 μ A/ 胶）？ 电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，修饰蛋白，从而对等电聚焦产生影响。 4.跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？ 刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动，而蛋白质运动需要较高的电压。 5.跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？ 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。 6.跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？ 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 7.跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ 等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中性分子。这时加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。 8.重泡胀缓冲液（rehydration buffer）中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？ 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。 9.怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？ 可以根据胶条的pH范围和长度估算蛋白质点的pI值，在第二向中加入分子量Marker估算蛋白质点分子量。也可以用体系内已知蛋白来做比对。 10.为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？ 横的脱尾可能是：1）一向等电聚焦不完全； 2）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3）蛋白的丰度太高。竖的脱尾可能是1）平衡时碘乙酰胺量不足；2）跑二向时，蛋白的溶解度不好。 11.什么成分会影响 2D 胶的效果？ 核酸，盐，去垢剂等等。 12.2D 胶的上样量应该在什么范围？ 上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。 13.我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？ 蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。
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