双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-1
一、蛋白质组学概论
随着人类基因组计划的实施，生命科学步入了后基因组时代，出现了不同于以往经典生物实验科学的全新的研究方式─“生物大科学”。这种生物大科学的核心思想是整体性研究，即以生物体内某类物质为对象进行完整的研究。过去对生命活动的研究仅限于研究细胞内个别的基因或蛋白质，而基因组学和蛋白质组学的目标则是细胞内全部的基因和蛋白质。因此，生物大科学与经典实验生物学在研究思路上有一个重要的区别：前者通常不针对具体的生物学问题或科学假设，其目标主要是把全部研究对象测定清楚，被称为“发现的科学”（Discovery
Science）；而后者属于“小科学”，其实施则离不开具体的生物学问题或科学假设，被称为“假设驱动的科学”(Hypothesis-driven
Science)。显然，生物大科学与经典实验生物学各有其所长，前者“广”而后者“深”。如何把这二者有机地结合起来，使得人们能够更深刻更全面的揭示生命复杂体系和行为，这是后基因组时代生命科学工作者面临的重要课题，系统生物学（Systems
Biology）就是针对这样一个时代需求而产生的生命科学研究领域的一门新兴学科。它以基因组学和蛋白质组学为基础，通过实验观察和数学建模的反复迭代过程来描述和预测生物系统的动态行为。
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蛋白质组学是系统生物学的基础和组成部分之一，在后基因组学时代的地位尤为突出。蛋白质组学的内容包括：表达蛋白质组学（expression
proteomics）、结构蛋白质组学（structural proteomics）和功能蛋白质组学（functional
proteomics）。双向电泳是蛋白质组学研究的经典方法之一，特别是对于表达蛋白质学的研究是不可缺少的手段。
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis,
2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美
”。
双向凝胶电泳是一种由任意两个单向凝胶电泳组合而成的，即在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳。双向电泳的思路最早是由Smithies和Poulik提出，蛋白质第一向根据其自由迁移率（free-solution
mobility），在滤纸条上进行的；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。随着聚丙烯酰胺凝胶的发明，双向电泳支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶，即双向凝胶电泳。1969年，双向电泳在原理上有了新的发展，建立了以等电聚焦为第一向的双向电泳技术（即IEF-PAGE）。20世纪70年代初，第二向电泳中使用了十二烷基硫酸钠（SDS），使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础.1975年O′Farrell首先建立了等电聚焦/SDS-聚丙烯酰胺双向凝胶电泳（IEF/SDS-PAGE），至今仍不失为双向凝胶电泳首选的组合方式。在这项组合中，IEF为第一向电泳，是基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦法分离，第二向则按分子量不同用SDS-PAGE分离，把复杂的蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进，已成为研究蛋白质组的最有价值的核心方法。目前，双向电泳最高可达11
000个蛋白点的分辨率。所以在上世纪90年代中期Wilkins提出蛋白质组学这一概念后，双向电泳即成为这个革命性课题的开门技术。
目前，双向电泳主要指O′Farrell建立的等电聚焦/SDS-聚丙烯酰胺双向凝胶电泳（IEF/SDS-PAGE）的模式。其基本原理是：先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度）进行等电聚焦，即按照它们等电点的不同进行分离。然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。样品中的蛋白经过等点电和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息。值得注意的是，双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。根据Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子质量的增加。
二、样品制备
1．[基本原理]
要获得高分辨率和高度重复的双向电泳图谱，蛋白质样品制备是极为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响双向电泳的结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：（1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；（2）减少对蛋白质的人为修饰；（3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。
根据这一原则，我们制备裂解液来抽提蛋白。裂解液的基本成分为尿素、去垢剂、还原剂和两性电解质等。尿素是一种优良的变性剂，通过断裂氢键和疏水键使蛋白质变性，增加其溶解性，而不影响蛋白质所带的电荷。尿素和硫脲结合使用蛋白质的溶解性会更好，尤其是疏水性的膜蛋白。去垢剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。离子型去垢剂，如SDS使蛋白质带上负电荷，干扰第一向等电聚焦而避免使用。传统的非离子去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX-100等，近几年较多的改用如CHAPS与Zwittergent系列等兼性离子去垢剂代替。还原剂多数使用β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇（DTE）通过打断二硫键使蛋白质彻底变性。两性电解质能促进蛋白质的的溶解，吸附高浓度的尿素在溶液中形成氰酸盐离子(cyanate
ions)，离心时还有助于核酸的沉淀。样品中的核酸大分子会干扰等电聚焦和双向胶的银染，加入核酸水解酶或采用超声的方法可将其降解。为避免样品制备过程中蛋白质的降解，整个过程需要在yena中（约4℃）进行，并可加入蛋白酶抑制剂.
