CAR-T疗法之改善的道路
近几年CAR-T因其在白血病等液体瘤上的巨大潜力，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一，然而依然存在如免疫抑制微环境、T细胞效力不强及细胞毒性等难题制约着CAR-T功效的发挥。前两期我们已经学习了CAR-T的基本知识，本期，我们就为大家介绍，CAR-T疗法中影响T细胞功能（增殖能力和免疫功能）的一些小明星分子，如细胞因子IL-7、IL18、IL-21，IL15等在肿瘤免疫方面的功效。也许它们可以为CAR-T的效力提升打开新的一扇窗。
什么是细胞因子？
细胞因子（cytokine，CK）是一种主要由活化的免疫细胞分泌的、介导和调节细胞功能（免疫反应、炎症反应、造血功能等）的小分子可溶性蛋白质。根据功能不同，可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等几大类。
细胞因子与肿瘤的关系
近年有实验结果表明：给肿瘤局部注射细胞因子IL-2，大量粒细胞和巨噬细胞被招募至肿瘤区域甚至是渗透到肿瘤内部，致使发生强大的抗肿瘤作用，最终肿瘤退化。除此之外，一些其他的细胞因子如IFN-α、GMCSF等也可以诱导肿瘤细胞死亡，这提示CK在抗肿瘤领域具有的广阔的应用前景。
细胞因子与CAR-T的关系是什么呢？
目前肿瘤免疫疗法CAR-T发展如火如荼，但是依然存在阻碍，如T细胞寿命短，效力不够等，这些问题严重阻碍了CAR-T治愈肿瘤的功效，特别是在实体瘤根治上。鉴于细胞因子的抗肿瘤功能，不难想到，也许共表达这些细胞因子会解决这一难题，并有望成为攻克实体肿瘤的重要手段。
如第四代CAR-T：在第二/第三代CAR-T的基础上共表达一些关键的细胞因子中就表现出了克服实体瘤免疫抑制微环境的能力。
以IL-12为例，系统注射IL-12会引起严重的炎症副反应，但是通过共表达IL-12的第四代CAR-T细胞来实现局部表达后，可以在肿瘤病灶处招募NK细胞，或者直接逆转被耗竭的肿瘤浸润性T淋巴细胞，从而有效克服肿瘤免疫抑制微环境。还有一些研究发现，在CAR-T细胞中共表达某些趋化因子，也可以增强CAR-T细胞的归巢能力。
因此，尝试着将具备重要免疫调节能力的细胞因子在CAR-T细胞中共表达，如IL-7、IL18、IL-21，IL15等细胞因子，很可能对T细胞的活性有很大的提升。
本期就先为大家介绍一下细胞因子IL-7的功能及与肿瘤免疫的关系。
人白细胞介素7（interleukin-7，IL7）是一种多效细胞因子，具有广泛的免疫效应。长期以来，对于IL-7的认识一直处于影响B细胞和T细胞的生长、存活及分化[1]。但在近年来，某些研究表明IL-7在抗肿瘤方面有直接或间接的作用。下面就一起来看看IL-7的发现、功能及应用。
IL-7的发现 1987年Hunt等人在实验中发现，1988年Namen等将其纯化、克隆出来，命名为淋巴细胞生成素-1，同年被命为白细胞介素7。IL-7/IL-7R介导的经典的信号通路如下图一所示[4]：
IL-7与T细胞有什么关系呢？
1. 调控T细胞的发育
Ｔ细胞在胸腺发育过程中，受IL-7Rα表达的调控。在TCR介导下也可重新诱导IL-7Rα表达。如图为：IL7/7R调控T细胞的发育。TCR信号持续，IL-7R信号受阻，分化为CD4+单阳性T细胞；TCR信号的终止，IL-7R信号传导，分化为CD8+单阳性T细胞[5]。
2.促进T细胞的增殖
研究发现，IL-7的表达与T细胞增殖密切相关。如用IL-7刺激新鲜T细胞，T细胞可剂量依赖性扩增，包括CD4+和CD8+亚群；敲除IL-7R，T细胞会停止生长；转入IL-7基因可促进CD4+/ CD8+T细胞的增殖。但CD4+和CD8+T细胞对IL-7对有不同的应答效果。IL-7对CD8+T细胞亚群的作用要强于CD4+细胞亚群[6, 7]。
如下图，Lisa A等人在探究IL-7激活T细胞是否与诱导增殖有关实验中，通过给小鼠体内注射IL-7，能够诱导活化状态下T细胞增殖，并且给药时间越久，增殖倍数越大；并且IL-7注射时间大于4天后，CD8+T细胞亚群的增殖倍数要强于CD4+细胞亚群。
3.延长记忆性T细胞的存活时间
IL -7Rα会选择性地表达于初次免疫应答中的小部分效应T细胞，而后转化为中枢性记忆性T细胞。并且IL-7对于记忆T细胞的存活尤为重要。而在淋巴细胞减少症中，IL-15对于记忆性T细胞的作用可以被IL-7取代[8]。
4.抗肿瘤作用
早在1994年，McBride等人将重组人IL-7注射人纤维肉瘤小鼠的肿瘤基底部，发现IL-7能抑制肿瘤生长，甚至使部分小鼠肿块完全消退[9]！！！这是因为重组人IL-7腹腔用药能使正常或荷瘤小鼠脾、淋巴结中白细胞增多，表明外源性注射IL-7体可以诱导了机体抗肿瘤免疫机制。
David H. Lynch等人通过向特异性抗肿瘤的CTL细胞（细胞毒性T淋巴细胞，一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用；对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用），培养基中添加IL-2/4/7，探讨这3种细胞因子对CTL细胞抗肿瘤能力的影响。结果显示IL7是最有效的；单独或与低剂量的IL2组合，CTL的扩增能力增强6-8倍；而只添加IL7时，抗肿瘤能力较对照组强4倍；单独添加IL4或与IL2组合，抗肿瘤能力较对照组低于4倍[10]。
IL-7目前有哪些临床应用呢？
介于IL-7强大的免疫效应，尤其是调节Ｔ细胞的增殖、维持其细胞内环境稳定，并能增强T免疫应答的能力等的功能，使得IL-7作为一种免疫调节因子越来越受到关注。
目前将IL-7应用于免疫治疗已进入临床并取得一定的疗效，其中包括黑色素瘤和淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌等等。
如Möller等人通过将IL-7修饰自体肿瘤疫苗，经皮下注射给恶性黑色素瘤患者，发现所有患者均耐受瘤苗，副作用少。免疫监测其中8例患者，发现杀伤T细胞数量显著增多。只有其中2例在接种后1天出现低热和轻度流感样症状。
截止目前的临床数据一致证明：IL7具强大的扩增初始T细胞和抗肿瘤能力。并且其副作用少，患者可耐受。这为IL-7用于肿瘤治疗提供了契机。
综上，对IL-7用于肿瘤治疗应用前景予以期待
①制备第四代CAR-T细胞。传统的二代、三代CAR-T细胞在体内的存活时间较短，扩增能力较弱。共表达IL-7可以延长CAR-T细胞的存活时间并提高扩增能力和杀伤肿瘤的能力；
②制备更强大的免疫性能的瘤苗。将IL-7与其他生长因子(如B7)共同转染瘤细胞，可提高瘤细胞的免疫原性，从而诱发机体产生更强的抗肿瘤作用；上一期，我们对CAR-T疗法已经有了一些初步的认识。因其在肿瘤免疫治疗中的巨大潜力，成为了备受世人瞩目的一颗新星。所有的成功并非一蹴而就，CAR-T亦是如此，那么它是如何一步步从不知名的小人物蜕变成家喻户晓的大明星呢，今天就带大家看看CAR-T这几代的成长之路。
与其他许多新兴的肿瘤治疗方式一样，CAR-T的问世并非一帆风顺，公众质疑声一直存在，如实效性、持续性、安全性、通用性等问题，加重了人们对CAR-T疗法发展和转化应用的顾虑。然而令人欣慰的是，经过几十年来的发展和改进，CAR-T疗法也经历了一条不断完善、成熟、优化、提高的发展之路。
从技术和功能特点的角度，CAR-T至今已经发展出了五个技术代系
那CAR-T是如何发展到第五代，各自的技术特点以及临床前或临床应用怎样呢，本期栏目就给大家来细细道来。
I代CAR-T雏形：ScFv -铰链区 -跨膜区 -CD3z融合表达的结构
出现时间：1989年，美国科学院院刊(PNAS)报道了第一代CAR-T疗法
结构：通过基因修饰使T细胞表达特异性肿瘤细胞表面抗原的分子单链抗体，结合一胞外铰链区和跨膜区以及胞内的T细胞激活受体CD3z链，靶向B细胞恶性肿瘤的CD19和CD20蛋白分子。
特点：效用低，易耗竭
临床应用：第一代CAR很快就被投入临床试验，但是虽能看到一些特异性的细胞毒性，但2006年对其进行临床试验总结的时却发现疗效差强人意。究其原因在于第一代CAR-T细胞在病人体内很快就会耗竭，其持久性（persistence）很差，以至于CAR-T细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已凋亡。
II代：加入T细胞活化和生存必需的共刺激信号分子
出现时间：1998年，面对第一代CAR-T的缺陷，第二代CAR-T 技术应运而生
改进结构：将T细胞活化和生存必需的共刺激信号分子CD137（或CD28、ICOS、OX-40）组装进CAR，提升CAR-T细胞在体内的扩增能力和存活能力。
特点：效果显著，发展成熟
临床应用：率先在小鼠B淋巴细胞性白血病模型中取得成功，并在随后的临床试验中其表现也超出了预期效果，对于复发或难治性急性B淋巴细胞白血病（r/r-ALL）患者的缓解率高达90%以上。基于其显著的肿瘤杀伤效果，目前开展的临床试验多是第二代CAR-T。
最值得一提就是获FDA专家一致推荐批准上市的诺华主打的 CAR-T 药物 CTL019，就属于二代 CAR-T 的范畴，胞内信号区共刺激信号为CD137（即4-1BB）。
此外，Juno Therapeutics 研发的JCAR014，JCAR015，JCAR017 产品， Kite Pharma研发的KTE-C19以及Bluebird/Celgene研发的CART19等产品均属于第二代CAR-T。
III代CAR-T：两条腿走路，反倒崴了脚
既然整合了共刺激信号后能够显著提高CAR-T的治疗效果，而T细胞拥有数量众多的共刺激信号分子，那么将这些共刺激信号分子共同整合进CAR分子结构中，治疗效果不就相对于二代CAR-T更为理想了吗？这一想法从多方面来看似乎就是个非常不错的idea由此第三代CAR也就随即问世了。
改进结构：通用的做法是在第二代CAR的基础上再增加一个共刺激信号分子，比如将CD28-CD137（4-1BB）分子同时组装进CAR里面。早前报道的Uppsala University 研发的靶向CD19分子的CART19 (NCT02132624)即属于第三代CAR，胞内信号区共刺激信号也为CD28-CD137。
特点：然而，存在很大缺陷，细胞迅速耗竭，复发率较高
有研究表明，CD28与4-1BB相比存在重大缺陷：CD28的特点是刺激CAR-T细胞在体内迅速扩增（细胞因子风暴风险大大提高），但同时也使得细胞迅速耗竭，复发率较高。总体来说，共同整合有CD28分子的三代CAR-T疗效并不比二代CAR-T优良，甚至在有些时候会造成灾难性的后果（这就尴尬了，囧~~）。
临床应用： JUNO以CD28为共刺激结构域的CAR-T产品（CD28zCAR）JCAR015在临床试验中很不顺利，先后发生5起死亡事件。2017年3月，Juno宣布放弃JCAR015，转而重点发展同样为CD19靶点、以4-1BB为共刺激结构域的CAR-T产品（4-1BBzCAR）JCAR017及JCAR014。
JUNO的教训令各大CAR-T研发机构惊魂未定，心有余悸，使得三代CAR-T在人们的失望中悄然谢幕，即使仍有部分研究，但CAR-T的主力军大旗已经毫无悬念地转到了二代CAR-T之手。三代CAR-T就这样刹羽而归，不过即便如此也并不能浇灭人们对于CAR-T疗法的信心，CAR-T技术的研发和改进仍然在路上。
IV代CAR-T：调节基因，性能升级
改进结构：在第二/第三代CAR-T 的基础上共表达一些关键的细胞因子或共刺激配体，可以显著提升T细胞扩增活性和寿命。该类CAR-T技术也被称为“TRUCK”。
特点：最新进展中，第四代CAR-T表现出了克服实体瘤免疫抑制微环境的能力，有望成为实体肿瘤治疗中的重要手段。
以IL-12为例，这一细胞因子被誉为T淋巴细胞的第三信号分子，可见其对T细胞功能的重要性。系统注射IL-12会引起严重的炎症副反应，但是通过共表达IL-12的第四代CAR-T细胞来实现局部表达后，可以在肿瘤病灶处招募NK细胞，或者直接逆转被耗竭的肿瘤浸润性T淋巴细胞，从而有效克服肿瘤免疫抑制微环境。还有一些研究发现，在CAR-T细胞中共表达某些趋化因子，也可以增强CAR-T细胞的归巢能力。
此外，其它具备重要免疫调节能力的细胞因子也正在被人们尝试着在CAR-T细胞中共表达，如IL-7、IL18、IL-21，IL15等，我们将在后续栏目中跟大家详细介绍这几个重要细胞因子及其与CAR-T研究的进展，敬请关注~
当然，细胞因子风暴本来就是CAR-T治疗过程中的关键副作用之一，整合细胞因子共表达似乎是在“火上浇油”，而研究人员也注意到了这一点，在另外一些临床研究中，科学家们正在尝试设置“分子开关或基因开关”机制，试图控制CAR-T在体内的功效，必要时中止细胞因子释放，避免对机体的伤害。
整合细胞因子表达实现了CAR-T细胞在肿瘤杀伤功能与微环境调节方面的升级换代，其临床效果、适用性、安全性、稳定性如何，相信未来会有不少临床前和临床数据来回应业内关切，我们拭目以待！
V
代CAR-T：通用型，闪亮新星
改进思路：尽管CAR-T细胞疗法拥有多种优势，但其高度个性化的特质使其不便于cGMP生产管理和进行大规模即时应用，且治疗成本高昂，因此，开发通用型的CAR-T细胞疗法以弥补上述不足，正逐渐成为CAR-T细胞治疗领域的必然趋势之一。
改进结构：通用型的CAR-T本质上是一种同种异体CAR-T细胞疗法，利用基因编辑技术，不需要依据患者进行相应修饰，而是直接将来源于非患者(non-patient) 供体的T细胞进行工程化，用于多个患者的治疗。简单来说，就是从健康捐献者身上获得T细胞后将T细胞的HLA基因及TCR基因敲除，避免宿主对输注CAR-T细胞的免疫排斥（或移植物抗宿主病），从而生产出通用的T细胞产品，此类产品理论上可用于多个患者的临床治疗。
临床应用： 近期，通用型CAR-T细胞疗法也给我们带来了一个又一个惊喜。2月7日，Cellectis公司宣布其通用型CAR-T疗法UCART123获得了美国FDA的IND（Investigational New Drug)批准，成为第一款获美国FDA批准进入临床试验的此类产品。3月10日，施维雅（Servier）、辉瑞（Pfizer）和Cellectis公司联合宣布，美国FDA批准了通用型CAR-T疗法UCART19 IND资格，可在美国进入临床发展，用于治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病适应症。
对第五代通用型CAR-T疗法在临床上的治疗效果，我们也在持续关注和期待中！ 同时，我们也希望在世界各国研究人员的共同努力下，CAR-T细胞疗法未来能取得更好更快的发展，让越来越优质的CAR-T疗法尽快问世，造福广大患者！
③IL-7与其他细胞因子联合使用。IL-2是目前公认具有较强抗肿瘤作用的细胞因子之一，但是临床应用来的毒副作用较大，IL-7副作用少，因此可减少IL-2用量，以减轻毒副作用。
综上所述，IL-7在肿瘤免疫方面发挥着巨大功效，如调节Ｔ细胞的增殖、维持其细胞内环境稳定，并能增强T免疫应答的能力等，相信若是IL-7恰当地参与到肿瘤免疫中，如共表达到CAR-T，也许会给CAR-T带来不一样的抗肿瘤的功效，让我们拭目以待。
