Taqman-PCR技术检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和解脲尿原体...
Taqman-PCR技术检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和解脲尿原体的意义
临床尿道炎患者中，淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和解脲尿原体通常为共同感染状态，但常用的检测方法尚不能精确检测和鉴别，开发精确、灵敏、快速、无污染的临床诊断方法已经成为预防性传播疾病的重要措施。随着分子生物学的发展，基于Taqman-PCR技术检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和解脲尿原体的诊断方法使得性传播疾病的诊断研究迈向了一个新的发展时期。
在性传播疾病病原体的诊断中，目前主要采用涂片法、细胞培养法、免疫荧光法和PCR法等方法，前三种方法具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点。而常规PCR法虽然具有简单、快速、灵敏的优势，但不能精确定量，且需对PCR产物进行后处理，不仅费时，且容易交叉污染，导致检测结果假阳性，同时对实验人员可能造成潜在的危害。
Taqman-PCR技术通过特异性的Taqman荧光探针检测项目的基因。Taqman荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Tap酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累计与PCR产物形成完全同步。
Taqman-PCR技术以闭管模式在PCR反应的同时检测靶基因扩增信号，从而增加检测特异性，并降低交叉污染。另外，该技术不需进一步的下游分析，缩短了检测时间。应用多色荧光检测系统，可在同一PCR反应体系中加入多对特异性引物及探针，一次扩增多个DNA片段，实现多病原体的同时检测。
基于Taqman-PCR技术的临床诊断研究
① 淋病奈瑟菌（NG）的临床诊断
应用Taqman探针，来自日本的中村克与同事对90例临床样本中的NG进行了定量检测，同时还发现部分样本中与耐药相关的ParC基因存在突变。荷兰杰隆波许医院的研究者通过Taqman-PCR技术，高灵敏度和高特异性地保证了临床448例样本中NG的诊断检测。美国霍普金斯大学的学者应用Taqman探针对耐喹诺酮类的NG样本进行研究，并确认了该方法在临床诊断检测过程中的准确性。这些研究表明，Taqman技术不但为NG的临床诊断检测提供了准确高效的方法，同时还有助于挖掘潜在的耐药机制。
② 沙眼衣原体（CT）的临床诊断
陆中奎建立Taqman-PCR方法对广东地区345例临床样本的CT进行检测，且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲尿原体、大肠杆菌等病原体DNA以及人基因组DNA均无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。以巢式PCR参比，Taqman-PCR方法检测CT的阳性符合率为100%，阴性符合率为95.09%。荷兰阿姆斯特丹大学医学中心的研究人员应用Taqman探针准确检测出152例CT感染阳性样本。德国海涅大学临床中心和日本兵库医科大学的学者分别应用Taqman-PCR对临床样本中的CT进行了快速、准确的定量和分型。这些研究表明基于Taqman探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点，可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA，适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选。
③ 解脲尿原体（UU）的临床诊断
董春雷和朱长太建立Taqman-PCR方法对苏州地区105例临床样本的UU进行检测，结果显示特异性高达100%，CV值为2.5%。来自瑞士波恩大学传染病研究所的学者建立了两种Taqman-PCR方法，高灵敏性地对解脲尿原体进行了定量检测。日本三菱化学生物临床实验室的吉田隆和他的同事应用Taqman技术对1999-2002年丰田纪念医院的临床样本进行了准确的解脲尿原体的定量检测和分型。这些研究说明Taqman-PCR技术检测解脲尿原体生物群线性范围宽、灵敏度高、特异性及重复性好，能够快速进行解脲尿原体生物群检测。
④ 淋病奈瑟菌（NG）、沙眼衣原体（CT）和解脲尿原体（UU）的综合诊断
澳大利亚昆士兰大学的研究人员利用Taqman-PCR方法对900例临床样本中的CT和NG进行检测，确认Taqman-PCR技术在临床诊断检测中的高灵敏度和高特异性。英国皇家利物浦大学的研究者采用Taqman技术对1028例尿液样本中的CT和NG进行了准确的定量检测和验证。程鹏飞、唐景峰等利用Taqman探针技术对湖北地区203份泌尿生殖道感染NG、CT、UU的临床样本进行同步检测，并与常规PCR及基因测序结果进行比较，显示Taqman-PCR技术法的阳性检出率最高，灵敏度为100%，三种病原体检测特异性均高于98.5%。
上述研究显示，Taqman-PCR技术集PCR扩增、杂交及荧光自动化检测于一体，实验过程简单、快捷、易于质控，对临床标本中性病病原体NG、CT、UU进行定性检测，体现出较高的灵敏度和特异性，具有较高的临床应用价值。同时，Taqman探针技术融汇了PCR高灵敏性、DNA杂交技术的高特异性和高精确定量等优点，提高了检测效率，对提高临床诊断治疗水平及流行病学调查具有重要意义。
