帕金森病模型的制作实验
| 实验方法原理 | 帕金森病(Parkinson disease, PD)是中老年常见的基底节神经元进行性退行性疾病，主要累及黑质和纹状体多巴胺递质系统。6-胫基多巴胺(6-0HDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)是两种主要的多巴胺能神经毒性物质，可以很好的模拟PD患者的临床表现和病理改变。由于6-OHDA不能通过血脑屏障，需立体定向注入脑内，目前多采用黑质致密部(SNc)、纹状体(cs)、中脑腹侧被盖区(VTA)、前脑内侧束(MFB)等部位进行注射；MPTP有高度的亲脂性，易通过血脑屏障，选择性浓集于黑质，通常经腹腔或皮下注射。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1.6-OHDA致大鼠PD模型的制作： (1)SD大鼠称重，按每笼5-6只饲养。在实验设计的时间点，将大鼠以1%戊巴比妥钠麻醉，待动物失去知觉即可开始操作。 (2)大鼠用立体定位仪将双耳及门齿固定。自矢状缝皮肤划开，棉球止血，定位，钻孔，挑破脑膜（以黑质致密部单侧损毁为例，参照Paxinos图谱确定注射坐标，前颅后5.2mm,左侧或右侧旁开2.2mm,进针深7.8mm)。 (3)微量注射器注射，以浓度2µg/µL，注射速度1µL/min注射，并留针10min,以1mm/min的速度退针。止血，缝合伤口。在实验动物苏醒的过程中，注意保温，观察各项生命体征。156第四章，神经系统疾病常用动物模型的制作在手术后的数周内，观察动物的进食、体重、行为学变化等情况。单侧损毁的方法，技术上比较成熟，操作较易、死亡率低，模型相对稳定，易区分双侧肢体运动细小异常，能对比患侧黑质的手术前后及与正常侧表现。双侧毁损是较大范围神经化学和行为学损伤，更似人类PD。但对基底节下丘脑等特殊区域损伤较大，死亡率很高，且操作较繁琐，目前PD实验研究中较少应用。: 2.MPTP致小鼠PD模型的制作： C57/BL小鼠称重，每笼5-6只左右。戴手套将小队的头颈部、尾部固定，经腹腔或皮下注射，单次注射的剂瞿为20-30mg/kg。根据实验要求和目的，可分为快速模型和慢速模型。快速模型可分为单次注射和多次注射。单次注射的剂最为30mg/kg,该模型损伤轻，易恢复；多次注射的剂量为20mg/kg,每隔2h注射1次，共3-4次，该模型损伤快且严重，DA神经元的损伤到死亡可以在3d内完成。慢速模型需多次注射，每天1次，单次注射的剂量为20mg/kg,连续注射5-7d。该模型的成活率较高，实验周期较长。 3结果判定：PD模型可通过体重检测、旋转杆实验、旷场实验、悬挂测试等进行评价。黑质多巴胺神经元的损伤程度可通过阿扑吗啡（或苯丙胺）引发的向健侧（或伤侧）旋转运动来较好地评估。与对照组相比，成功的模型组会出现明显的体重增加缓慢、自主活动减少等特点。另外，通过免疫组化或分子生物学的方法观察黑质、纹状体等部位的TH表达的明显减少也是判定PD模型成功与否的一个金标准。 展开 |
| 注意事项 | 1.MPTP有剧毒，在称量溶解和注射时一定做好个人的防护工作；MPTP、6-OHDA等试剂现用现配。 2实验分组及动物较多，一定要做好标记，以免混淆，造成实验失败。 3.SD大鼠在造模后，一定注意保温、吸痰。根据大鼠的夜间习性，下午或晚上造模的成活率更高些。 4.小鼠应激反应较强，抓取时应带厚的手套，以免被咬到。 5.小鼠在注射MPTP后30min内会出现颤抖、口角抽揣、肢体平衡能力差等一系列行为学的改变，可能是MPTP对肾脏、肝脏等器官产生的毒害作用引起的一些生理指标，如血压、体温和肝功能等的变化。因此，应在MPTP最后一次注射后第3天或第4天以后再进行行为学测试，更能客观地检测小鼠PD模型的行为学变化。 6.6-OHDA致PD模型定位注射时注射速度宜缓慢，过快可导致注射范围扩散；微量注射器选择时避免注射针头过粗造成损毁区域增大。 7.进行行为学实验时，尽星避免外界环境（嘈杂、强光等）的干扰。 展开 |
| 其他 | 造模的成功与否，决定了进行各相关指标检测结果质址的好坏。制备PD模型选取时需综合考虑造模目的和用途、靶点的位置(SN,CS、vTA、MFB)、药物剂量多少和浸润范围大小、损伤的程度（部分、完全）、动物的安全性（死亡率）和有效性（成功率）、操作难易性、精确性和稳定性等等。因此，在两模型具体应用时要有所选择： ① 根据药物特性选择建模方法6-OHDA需立体定向注入靶位、MPTP经腹腔或皮下注射； ② 根据药物敏感性选择动物大鼠对6-OHDA敏感，制备模型时按前述因素综合考虑，灵长类对MPTP最敏感但受限制，而常用小鼠； ③ 根据应用目的和用途选择模型6-OHDA注射靶位选取灵活，注射剂量可调，动物行为变化稳定可靠，检测量化性好，多用于PD的临床前药物研究和药理疗效判定、神经保护、细胞移植和基因治疗等方面的研究，MPTP用药方案多样，诱导产生的症状及病理、生化改变方面与人类PD更相似，主要用于PD病因、发病机制，药物毒理试验等研究。 展开 |
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