Southern印迹杂交实验原理和方法-3
真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和整个过程约需30～60分钟。但在操作中应注意两个问题，一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。下表列出了不同的印迹方法。
表10－2 不同印迹方法的比较表
五、探针标记
用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4
多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，详细方法参见本书相关章节。
这里介绍放射标记。以下为 Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：
（一） 取25～50mg模板DNA于0.5ml离心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。
（二） 在另一个0.5ml离心管中加入：
Labeling 5×Buffer (含随机引物) 10μl
dNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L) 2μl
BSA(小牛血清蛋白) 2μl
[α-32ρ] dATP 3μl
Klenow 酶 5U
（三） 将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混匀。室温或37℃ 1h.
（四） 加50μl终止缓冲液终止反应
标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。由于α-32ρ的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于 1091计数/分/μl。
六、预杂交（prehybridizafion）
将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。
具体步骤如下：
（一） 配制预杂交液
6XSSC
5XDenhardt’s试剂
0.5%SDS
50%(v/v)甲酰胺
ddH2O
100 ug/ml鲑鱼精DNA变性后加入
注：1. 每平方硝酸纤维素膜需预杂交液0.2ml。2. 预杂交液制备时可用或不用poly(A)RNA。3.
当使用32P标记的Cdna作探针时，可以在预杂交液或杂交液中加入poly(A)RNA以避免探针同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列结合。4.
按照探针、靶基因和杂交液的特性确定合适的杂交温度（Thyb）。（如果使用标准杂交液，靶序列DNA GC含量为40%，则Thyb为42℃。）
（二） 把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度。
（三） 将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，用5-10m l2×SSC浸湿滤膜。
（四） 将鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。
（五） 从塑料袋中除净2×SSC，加入预杂交液，按每平方滤膜加0.2ml。
（六） 加入变性的鲑鱼精DNA置终浓度200μg/ml。
（七） 尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，上下颠倒数次以使其混匀，置于42℃水浴中温育4h.
七、 Southern杂交
（一） 原理
转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA（探针DNA预先经加热变性成为单链DAN分子），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。
（二） 步骤
1. 将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。
2. 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变性的DNA探针加到预杂交液中。
3. 尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。
5. 置42℃水浴温育过夜（至少18h）。
八、 洗膜
取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗 5min，然后按照下列条件洗膜：
2×SSC/0.1%SDS， 42℃，10min
1S×SCC/0.1%SDS， 42℃，10min
0.5S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min
0.2×SSC/0.1%SDS， 56℃，10min
0.1×SSC/0.1%SDS， 56℃，10min
采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交还需注意的关键一步就是洗膜。在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。
九、放射性自显影检测
（一） 将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。
（二） 在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。
（三） 将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。
（四） 从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。
（注：注意同位素的安全使用）
实验结果及注意事项
在膜上阳性反应呈带状。实验中应注意以下问题：转膜必需充分，要保证DNA已转到膜上。杂交条件及漂洗是保证阳性结果和背景反差对比好的关键。洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性
若用到有毒物质，必需注意环保及安全。
