Cell Rep：用CRISPR/Cas诱导基因组结构变异
2月10日，德国马克斯普朗克分子遗传学研究所的研究人员在《Cell Reports》发表一项最新研究成果，题为“Deletions, Inversions, Duplications: Engineering of Structural Variants using CRISPR/Cas in Mice”。在这项研究中，他们创新性地使用CRISPR/Cas技术，在小鼠中快速而有效地产生基因组结构变异（SVs）。
基因组结构变异（SVs）是基因组DNA中大范围的结构差异，大小从几个kb到整个染色体。SVs在很大程度上引起了我们的基因组变异，它们往往与疾病有关。当发生在基因的编码序列中时，它们可能会影响蛋白质序列，从而影响蛋白质功能和稳定性。当包含一个或几个编码单元时，缺失或重复可导致基因拷贝数的变化。此外，有研究表明，SVs可能通过破坏适当增强子-启动子相互所有所必需的基因组结构，而干扰基因调控。这种重排可能导致WT相互作用和/或异位增强子-启动子相互作用的缺失，从而导致基因误表达。为了对这多种影响加以区分，并研究它们复杂的分子病理学，就必需建立SVs的体内模型。
SVs可被辐射诱导（通过诱导双链断裂），但这是一个随机过程，不能被靶定到特定的基因组区域。到目前为止，等位基因序列（包括大DNA片段的重构）已经从小鼠染色体中loxP靶向位点的顺式重组而获得。然而，这些方法费时费力，涉及loxP序列的靶定和随后小鼠与Cre工具属的杂交，这个程序至少要12个月。最近，锌指核酸酶（ZNF）或转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）已经被证明可在哺乳动物中诱导几百个kb的靶向SVs。可在斑马鱼中获得多达1Mb的体内染色体倒位和缺失。然而，据我们所知，这些方法并不适合在小鼠中产生大的结构变异。这可能是由于产生特定ZNF核酸酶或TALEN的过程相当缓慢，需要专门的知识。
最近发展的CRISPR/Cas技术已经使基因组编辑技术得以更广泛的使用，延伸阅读：厦大学者利用CRISPR/Cas9系统编辑疟原虫基因组。从而开辟了新的可能性，即在不同的模型系统中诱导SVs。事实上，两个合成的引导RNAs（sgRNAs）——靶定一个染色体上两个不同位置，可以通过非同源末端连接（NHEJ）诱导染色体倒位和缺失。例如，Xiao et al. （2013）通过向斑马鱼胚胎中直接注射sgRNAs和Cas9，从而诱导斑马鱼胚胎中1.5kb的缺失。同样的，在HEK293或小鼠eurythroleukemia (MEL)细胞系中也获得了更大的结构重排，包括缺失、插入和易位。
在这项研究中，研究人员在小鼠胚胎干细胞（ESCs）中使用CRISPR/Cas技术，开发出一个10周流程——他们称之为CRISVar (CRISPR/Cas-induced structural variants)，能够在小鼠中有效地产生缺失、倒位和重复。研究人员能够在ESCs中使用CRISPR/Cas系统，靶定范围在1kb到1.6Mb之间的基因组间隔。此外，该研究小组还表明，携带这些突变的ESCs，可用来制备嵌合体动物。最后，研究小组表明，在Laf4和Epha4基因座上，CRISVar能模拟人类致病SVs，并评价一个大基因沙漠（gene desert）的调控影响。
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