RNA的变性琼脂糖凝胶电泳实验原理、材料和操作步骤
实验方法原理 |
RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中,可以分离混合物中不同分子量的RNA分子,凡是无法确定分子量。只有在变性情况下,RNA分子完全伸展,其泳动率才与分子量成正比。 判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带,且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。 |
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实验材料 | 总RNA提取物 |
试剂、试剂盒 | DEPC水 电泳缓冲液 变性琼脂糖凝胶 上样缓冲液 甲酰胺 |
仪器、耗材 | 电泳系统 紫外透视仪 |
实验步骤 |
1. 将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。 2. 制胶: 称取0.5g琼脂糖粉末,加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中,加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶,插好梳子,水平放置待凝固后使用。 3. 加样: 在一个洁净的小离心管中混合以下试剂:电泳缓冲液(10x)2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀,置60℃保温10min,冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀,取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。 4. 电泳: 打开电泳仪,稳压7.5V/cm电泳。 5. 电泳结束后通过紫外透视仪观察。
展开 |
注意事项 |
本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制,用具也用DEPC水冲洗,并灭菌。
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