全转录组测序技术揭示circRNA新的调控机制（二）
3. 环状RNA的差异表达与前列腺癌的进展有关
研究者对144个前列腺癌进行了聚类分析，与线性RNA相比，环状RNA最强模式与它们在每个样本中的总体丰度相一致。另外，极端circRNA分布的患者的预后明显较circRNA分布稳定的患者差，同时极端circRNA index组也与更高的转移发生率相关。这种相关性排除了对应亲本来源的线性转录本的影响，种种迹象表明这种特异性表达的circRNA与前列腺癌的发生发展密切相关。
为了评估这些特异性circRNA的功能重要性，选取前列腺癌细胞系中数量最多的2000个环状RNA进行shRNA功能缺失筛选，位点靶向于反式剪切序列，然后对这些环状RNA敲除细胞系进行全转录组测序，同时耗尽其中的线性RNA以保证筛选的有效性，结果表明这些特异性的circRNA对细胞的增殖产生明显的促进作用，而不是线性RNA。
4. circCSNK1G3的功能特征
环状RNA分子circCSNK1G3非常特殊，其环状和线性形式表达丰度相似，经验证发现环状RNA形式在四种前列腺癌细胞系中是必不可少的，相反的，其对应线性转录本则是非必须的。为了研究circCSNK1G3促进细胞增殖的机制，研究者在PC-3细胞系中对circCSNK1G3进行敲除和过表达后进行全转录组测序（RNA-seq）分析。GSEA富集分析显示过表达样品中上调的许多基因在敲除样品中下调，反之亦然。另外两种环状RNA circSTAU2和circGOLPH3也出现了类似的模式，说明在敲除和过表达实验中观察到的表型并不是由靶外效应引起的。同时，敲除其线性转录本CSNK1G3后，并没有这种现象。最终证实circCSNK1G3对前列腺癌细胞增殖的促进作用与其对应线性转录本无关。
5. circCSNK1G3协同稳定miR-181b/d活性促进前列腺癌
环状RNA通常与miRNA相互作用发挥调控功能，首先通过预测找到了10个与circCSNK1G3作用的候选miRNA，进一步分析了circCSNK1G3与miRNA之间的相关性，最终确定了与circCSNK1G3表达显著相关的5个miRNA，分别是miR-181a/b/c/d和miR-196b。通过circCSNK1G3 pull down（云序生物提供此项服务）实验发现只有miR-181b/d显著富集，敲除circCSNK1G3降低miR- 181b/d丰度，过表达增加miR- 181b/d丰度。对ciRS-7也有类似的现象，敲除ciRS-7降低了其相互作用的miR-7。PC-3细胞系中miR-181b/d 过表达显著降低CBX7丰度，CBX7是一种特征良好的miR-181b靶点，也是前列腺癌的肿瘤抑制因子。与miR-181b/d在circCSNK1G3敲低后下调一致，CBX7丰度显著增加。同样的，在miR-181b/d 过表达细胞系中，细胞周期基因如CDK1、CDC25A上调，而在circCSNK1G3敲除细胞系中下调。与细胞周期基因上调一致，miR-181b/d过表达可促进PC-3细胞增殖。更重要的是，miR-181b/d的过表达显著减弱了circCSNK1G3的敲除诱导的细胞增殖阻滞。综上所述circCSNK1G3通过与miR-181b/d的相互作用促进前列腺癌细胞的增殖，且这种新的调控方式有别于海绵机制。
总结
总结一点：有充足的经费，有充足的样本，利用新分子circRNA做分子标志物，结合机制，登顶CNS不再遥远。
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