新时代下对于Western Blotting发表文章的新要求（三）
上一期我们聊了期刊杂志的新要求，总结如下：
▶ 不建议跑平行胶，因为平行胶和剥离膜，孵育体系，操作条件的不一致，影响定量的准确性，因此最好内参和目的蛋白要在同一张印迹膜上。
▶ 选择宽动态范围的方法，确认信号强度与所上样量之间的线性关系，例如用胶片做化学发光方法的动态范围就很窄，不建议使用。
▶ 强烈推荐使用总蛋白进行归一化，因为看家蛋白容易受处理条件影响而发生变化，影响定量的结果，使用总蛋白定量更真实地反映目标蛋白表达量的变化。
▶ 提交原始数据，例如：JBC，PLOS和CELL等杂志都要求要提供原始数据。
Azure公司除了有Sapphire双模式多光谱激光成像系统可满足需求， Azure600多功能分子成像系统也可帮助您获得期刊杂志要求的Western Blot数据：
▶ Azure600标配有5个荧光光源，可同时在一张印迹膜上进行4通道荧光成像 ，同时也具有高灵敏化学发光检测功能，灵敏度可达fg级
荧光Western Blot使用荧光基团标记的二抗进行检测，膜上的靶标蛋白浓度与可见荧光信号强度呈线性关系，实现真实可靠的定量分析。荧光染料发射光谱不同，因此在一张印迹膜上可实现多个蛋白检测。这样目标蛋白和内参蛋白在同一张膜上，可以避免数据造假的情况发生，更容易被期刊杂志接收。
图1：通过使用四种光谱不同荧光基团标记的二抗，可以同时检测多达四种不同的蛋白。HeLa细胞裂解物上样，Anti-Tubulin (550nm, 绿色), Anti-Actin (700nm红色), Anti-GAPDH (800nm, 灰色),和Anti-Transferrin (490nm, 蓝色)这四种蛋白同时成像，没有交叉。
▶ Azure600近红外采用激光光源， 激发强度大，单色性好，减少光泄漏，在更短的时间内达到更好的信噪比，Western Blot精准定量的金标准
▶ Azure600配合AzureRed总蛋白荧光染色剂可以做总蛋白归一化和定量三个靶标蛋白，生成可以信赖的定量Western Blot数据
使用总蛋白归一化，以校正泳道和样品之间的差异。传统的方法无法准确知道条带灰度值和强度的变化是由于样品的生物学变化引起的，还是由于上样不一致性或样品制备的差异引起的。总蛋白定量的优势如下：
★ 总蛋白比看家基因等内参的线性检测范围更宽；
★ 在整个实验和系统中更加稳定；
★ 能有效排除实验条件和体系对结果的影响；
★ 更真实地反映目标蛋白表达量的变化。
图2.总蛋白归一化和定量三个靶标蛋白. Tubulin 红色通道, Actin 蓝色通道,GAPDH绿色通道, AzureRed/Total protein 用灰色表示
图3.使用总蛋白对Tubulin信号进行归一化纠正上样误差
▶Azure600标配9.1MP的高分辨CCD，动态范围可达4.8OD，保证结果的准确性
图4.过饱和检测可防止定量误差，相同的印迹膜分别使用胶片成像和Azure成像系统，Azure成像系统具有过饱和提醒，自动计算曝光时间以避免饱和
▶ Azure600可做彩色Marker与化学发光条带的自动整合，分子量查看更直观
▶ Azure600提供原始数据16bit的tiff图给到期刊，这里的tiff原始数据是指未经裁剪，像素修改，对比度调整等任何操作的图，保证结果的真实性和可靠性
Azure600除了进行荧光印迹膜，化学发光印迹膜检测外，还可以进行普通凝胶成像，EMSA检测，菌落筛选，小动物成像，植物成像等。
