Western blotting Protocol(试剂配方和实验操作)
一、 试剂配方：
1X TBS: Tris-base 12.11g
Nacl 8.775g
用HCl 调pH7.4，用纯水稀释至1L
5X Transfer buffer: Tris-base 15.1g
Glycine 72.0g
To 1 L
10X碱性磷酸酶缓冲液： 1 mol/L Tris-HCl pH 9.5
1 mol/L Nacl
50mmol/L MgCl2
TTBS：1XTBS +TWEEN20（1000：1）
碱性磷酸酶显色液：2.5mL 1X碱性磷酸酶缓冲液+16.5µL NBT混匀, 再加8.25µL BCIP混匀。
辣根过氧化物酶显色液：10 mL 0.01 mol/L pH 7.6 Tris-HCl 溶解 6mg DAB，滤纸过滤（-20℃保存），显色时加10µL 30%H2O2（即按1000：1加）。
二、实验操作：
1、 SDS-PAGE，胶在电转液：1 X Transfer buffer + 20%甲醇+ 0.01%SDS (800mL/800µL 10% SDS) 平衡10min。
2、 处理尼龙膜：100%甲醇浸泡 5min,再加4倍体积的双蒸水，使甲醇终浓度为20%，浸泡5min。1 X Transfer buffer+20%甲醇（无SDS）浸泡10min。
3、 转膜：按黑（—极）—海绵—滤纸—胶—膜—滤纸—海绵—白夹子（+极），（在电转液：1 X Transfer
buffer+20%甲醇+0.01%SDS(800mL/800µL 10% SDS)中进行）夹好三明志夹，用冰包裹电泳槽，100V
或350mA转70 min。（注意底部靠其下槽，排除气泡，转完后切角作标记）。
4、 封闭：电转后膜用1XTBS漂洗1次，置于5%脱脂奶粉中（1XTBS+1000：1 TWEEN20），封闭过夜，或者37℃，30 min ~90 min。
5、 一抗：抗体（抗体稀释比例根据自身实验具体确定，推荐比例：抗血清常用1：100~1：5000 5%牛奶，培养液上清1：2~1：100，腹水1：200~1：10000 5%牛奶，），震荡孵育1或2小时。（一抗可回收冷冻保存）
6、 TTBS 洗三次，10 min/次。
7、 二抗：1：1000~5000 TTBS稀释（常用1：3000），室温震荡孵育1小时。
8、 TTBS 洗三次，10 min/次。
9、 显色：将膜放在PARAFILM膜上，滴加显色液5rpm（一般显色1 min即可，注意控制好时间，否则显色背景过深）。
10、纯水终止显色，晾干或滤纸吸干保存。
