免疫化学发光并非万能，单分子免疫检测未来可期（二）
在过去的近二十年里，数字PCR技术快速发展可以认为是分子诊断领域最令人振奋的技术进步。数字PCR技术（DigitalPCR）最早由Vogelstein于1999年提出，通过在96/384孔板中极限稀释DNA模板进行验证（图2）。
2003年Dressmam等发明了BEAMing技术，将磁珠、模板、引物等分散到小液滴当中，进行单分子级别的扩增，再利用磁珠对单分子扩增产品进行结合回收分析。
2006年Fluidigm推出了第一台基于微阵列芯片的商品化数字PCR系统。同年QuantaLife推出液滴式数字PCR技术，并于2011年被Bio-Rad公司以1.62亿美元收购，成为后来众所周知的QX-100系统，正式掀起了数字PCR在资本市场中的热潮。
2013年Bio-Rad推出升级机型QX-200系统。同年，LifeTechnologies推出了基于微阵列液滴芯片的QuantStudio3D系统，成为QX-200系统主要市场竞争对手。此后，受益于资本市场对数字PCR下一代分子诊断技术地位的认可和推动，国内外涌现了一大批各式数字化PCR技术平台。
2016年，法国Stilla公司推出了NaicaCrystal平台，首次推出了三色检测通道的数字PCR系统。2017年，伯乐完成对竞争对手RainDanceTechnologies的收购，基本完成在液滴式数字PCR细分技术领域的垄断。
数字化PCR技术的发展不仅推动了现有的分子诊断体系的进步，更为将来分子诊断市场在精准医学检测领域，例如基因组拷贝数突变、低丰度DNA模板检测、二代测序辅助建库、肿瘤治疗伴随检监测、稀有致病菌检测等，提供了必要的技术支持。
数字PCR是当前市场上最具有代表性的单分子检测技术，它是一种典型的信号放大依赖型的单分子检测技术，其本质是单分子独立的信号放大、识别与提取。数字PCR通过将样品分散到数万至数十万个独立反应单元（液滴或阵列），在每个反应单元中对模板分子进行独立扩增。扩增后通过测量反应单元荧光信号强度判断该单元是否含有模板分子，再根据含有模板分子的反应单元所占比例来换算样品中模板分子的浓度。
数字PCR的核心理论依据是泊松分布（Poissondistribution）。泊松分布是一种统计与概率学里常见到的离散概率分布，它描述了单位时间内随机事件发生次数的概率。对于数字PCR检测体系则是描述了在一定模板浓度的前提下（λ表示平均每个微单元平均出现的模板个数），在每个固定体积的微反应器（液滴或微阵列单元）中出现模板个数的概率。根据泊松分布公式，当目标浓度稀释到极限，λ远小于1趋近于0时，趋近于0，P（1）趋近于λ，故可通过绝对计数来实现绝对定量。
目前，市场上比较具有代表性的几个数字PCR技术平台及其主要技术特点如下表所示：
表1 几个具有代表性的数字PCR技术平台特点汇总
数字PCR技术对现有传统分子诊断技术的冲击，以及技术层面上单分子检测的策略方法，让一些人注意到了将单分子检测技术应用到体外诊断领域中，占据最大市场份额的免疫诊断的潜力。尽管近几年国内数字PCR技术的开发与推广依然处于如火如荼的快速发展阶段，国外更具有先进性战略眼观的企业与资本市场早已将启动了单分子检测技术在免疫诊断市场的产业化转化。
2010年，参考数字PCR检测原理，DavidWalt与David Duffy团队开发了“DigitalELISA”技术（Single-moleculeenzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolarconcentrations, Nature Biotechnology, volume28, pages595–599 (2010)）。该技术延续了数字PCR单分子检测逻辑，它以标记后的半乳糖苷酶催化底物产生荧光信号代替数字PCR过程中PCR进行信号扩增的过程，将标记有β半乳糖苷酶的单分子蛋白分散到高通量的微反应器中进行独立反应，通过对每个微反应器信号的检测和统计来实现单分子级别检测。
“DigitalELISA”技术的出现打破了业内对免疫检测技术检测灵敏度下限的认知，让业内意识到单分子免疫检测技术在医疗诊断市场产业化的可行性。其后，DavidWalt凭借“Digital ELISA”技术于美国成立Quanterix公司，推出单分子酶联免疫检测技术平台SiMoA。SiMoA一经面世便吸引了众多国内外业内人员和资本市场的关注，并在其后的几年内获得多伦高额的融资。
2015年，Merck公司收购Singulex公司SMC技术在生命科学研究领域的使用权（金额条件未披露），再次将单分子免疫检测技术推到资本市场的大舞台。而随着今年Merck公司主推的稳定性更好的第二代单分子蛋白检测平台SMCxPRO系统的大力推进，势必将引起一阵单分子免疫检测技术发展的热潮。
数字PCR技术的快速发展在技术层面上给了单分子免疫检测技术很好的启示和推动作用，它在过去几年里发展的历程也让我们意识到单分子检测作为下一代检测技术在体外诊断市场中势不可挡的发展趋势。
可以预测，如果说数字化PCR正处于体外诊断资本市场的风口之上，那么下一个进入体外诊断技术领域风口的有可能是单分子免疫检测技术。
