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有丝分裂(Feulgen染色法)

2019.4.27

实验原理:细胞中的DNA受1NHC1,60℃水解作用以后,核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉,使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。水解后,组织要经水洗再移至希夫(Schiff)试剂中,希夫试剂即同露出来的醛基发生反应,呈现紫红色。这个反应是Feulgen在1942年提出来的,是DNA的一个特异性检查法。 
水解的时间很重要,因为核酸的水解有两个过程,第一,漂呤碱很快被除掉,脱氧核糖中潜在的醛基显露出来,第二,组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。在短时间的水解作用以后,第一个过程占优势,这时候用希夫试剂染色,染色体的染色作用最强。随着水解作用的继续进行,第二个过程逐渐变成优势,因此水解液中的希夫反应增强,而染色体中的希夫应减弱。最后,第二个过程超过第一过程时,染色体也随之停止反应。 
希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液,呈无色。与DNA醛基反应后,使碱性品红恢复原来的红色。

 
二、实验目的:观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA,以及染色体在有丝分裂中的行为,掌握Feulgen染色方法。


三、实验材料:上次实验制成了石蜡切片。


四、实验准备: 
1.用具  立式染色缸一套,镊子,盖玻片,小漏斗,铁架,毛边纸,玻璃棒,显微镜,恒温水浴锅,温度计,烧杯,棕色瓶,黑纸。 
2.玻璃器皿的清洗   主要是染色缸的清洗,一般用肥皂粉洗,用水冲净即可,如不能洗净时,要用洗液浸泡后,再冲洗,自来水洗后,再用少量蒸馏水过洗一次。盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必须干燥,缸盖内缘必须涂以几士林,以防止蒸发和收水分,影响浓度。染色缸上要贴上标签。 
3.实验所需药口及配制 
浓盐酸(36—38%),碱性品红,偏重亚硫酸钠(Na2S2O5); 
亚硫酸钠(Na2SO3),固绿(fast green),加拿大中性树胶乙醇(30—100%),二甲苯。 
药品配制: 
1各种浓度的乙醇配制.
21NHCI配制:取浓HCI 82.5毫升加蒸馏水至1000毫升,摇匀。 
3Sciff 试剂的配制 
0.5克碱性品红,加到已经煮沸的100毫升蒸馏水中,再煮沸3—4分钟,待溶液冷却到50℃时过滤,再等溶液冷到25℃以下时,加入10毫升的1NHCI和1。5克偏重亚硫酸钠,装在棕色瓶中,塞紧瓶子,用黑纸包好,放在暗处,第二天观察,溶液还是淡红色就不能用,只得重配。 
偏重亚硫酸钠与1NHCI反应,放出SO2,SO2与碱性品红反应,生成碱性品红--亚硫酸溶液,呈无色。 
4漂染液的配制 
先配10%的亚硫酸钠溶液。 
把10%亚硫酸钠溶液10毫升加200毫升蒸馏水,再加10毫升1NHCI,即成漂当液。 
5固绿染色液 
0.5克固绿溶于100毫升95%乙醇溶液。


五、实验步骤:
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2.水解  先在恒温水浴箱中准备好恒温60℃的1NHCI。注意一定要控制好温度不能过高,高了醛基要破坏,低了小解不充分,醛基不能释放出来。水解的时间长短要根据材料,以及固定液的种类而定。根据试验结果,取一个适当时间。
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因加拿大树胶溶于二甲苯,所以片子一定要经二甲苯透明后才进行封片,操作方法如下:
1.用镊子从二甲苯中取出载玻片,以毛边纸吸干余液。
2.左手开启树胶瓶,右手用瓶中玻璃棒蘸取树胶滴于载玻片上,并随即盖好瓶盖。树胶的用量视盖玻片大小而定。要使树胶在盖玻片下满布,不发生过多或不足。
3镊取洁净盖玻片,以一边浇于载玻片上,然后徐徐放下,使树胶布满盖玻片与载玻片之间。产生气泡的原因是覆盖太快树胶用量不足,或树胶过稠。气泡侵入后,妨碍镜检,且使标本褪色。如有气泡产生,则可以在靠近气泡的一边再滴树胶一滴,然后轻压盖玻片,使气泡逸出。
片子封片后,放在切片木框上,让其自然干燥,即可保存。


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