DNA的细胞化学反应——Feulgen反应
实验概要
1、了解Feulgen反应的基本原理。
2、熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。
实验原理
Feulgen反应是1924年由Feulgen和Rossenbeck开创的。这一反应的原理是：DNA经酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。所以，凡有DNA的部位，会呈现紫红色阳性反应，可以作为定性研究DNA的一种简便方法。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性。
主要试剂
1、Carnoy固定液：3份95%酒精加入1份冰醋酸，混合即可。
2、1mol/LHCL：准确量取82.5ml浓盐酸（比重1.18）加蒸馏水到1000ml即可(应将盐酸缓缓加入水中)。
3、Schiff试剂：称1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸馏水中，5分钟后断电使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入1mol/L HCl 20ml，继续冷却至25℃，加入1g偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（4℃左右），18～24小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是Schiff试剂溶液。如有不同程度的红色未褪，可加入1g活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。
4、亚硫酸水溶液 (漂白液)：在200ml蒸馏水中，加入10ml 1N HCl 和10ml 10%偏亚硫酸氢钠水溶液（或1.0g固体）。此液在临用前配制。否则会因SO2的的逸出而失效。
5、5%三氯乙酸。
6、0.5%固绿酒精溶液（95%的酒精溶解）。
7、45%醋酸。
主要设备
显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、 剪刀、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、镜头纸、青霉素小瓶、吸管、烧杯、量筒。
实验材料
Carnoy液固定的大蒜根尖。
实验步骤
1、材料准备：取大蒜若干头，剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长25px时，剪下根尖固定在Carnoy固定液内24小时以上备用，固定时以冰箱中进行为宜。
2、水解：实验时，从冰箱取出预先准备好的大蒜根尖，分装到若干个青霉素瓶中，用自来水洗3次，蒸馏水水洗3次，换1mol/L HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1mol/L HCl 3ml，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解8-15分钟（视材料而定，水解时间可以从8分钟延长至30分钟）。然后吸去热1mol/L HCl，换入冷1mol/L HCl洗1次，再用蒸馏水将根尖洗3次。
水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中；反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。
3、染色：吸净水分，加入Schiff试剂避光染色40min~60min，用漂洗液漂洗2～3次，每次5min,然后经自来水流水冲洗，再用蒸馏水洗2次后准备压片。
4、压片法：取一根尖置于载玻片上，用刀片切下生长区部位（染成紫红色），加一滴0.1%亮绿水溶液对染一分钟，吸去亮绿液，加一滴清水或45%醋酸水溶液，加盖玻片，用拇指轻压使细胞分散均匀，镜检。
5、对照组预先用5%三氯醋酸（90℃）处理15min，然后再依次进行实验步骤2、3、4。
注意事项
1、Feulgen反应的染色深浅与材料、水解时的温度和时间都有关系。水解时间的长短要根据固定液和材料来进行选择，时间太短则游离的醛基量
少而染色不深，时间太长会因醛基进一步变成其它物质，染色也不深。水解时的温度要严格控制。
2、未经水解的对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (40分钟即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。
3、Schiff试剂的作用：Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几
种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。
4、漂白液的重要性：漂洗时，所用的亚硫酸水，最好在每次实验前临时配制，以便保持较浓的SO2。
5、操作过程中，用镊子镊取根尖的生长区部位，切勿夹取根冠部位。
